Un método para construir un polinucleótido sintético del cual se puede producir un polinucleótido para conferir un fenotipo seleccionado sobre un organismo multicelular de interés o parte del mismo en una calidad diferente que aquella conferida por un polinucleótido progenitor que codifica el mismo polipéptido,

el método comprende: (a) seleccionar un primer codón del polinucleótido progenitor para sustitución con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo se selecciona sobre la base de que este exhibe a una preferencia fenotípica diferente a aquella del primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas en organismos de prueba no humanos o partes de los mismos, en donde las partes de los organismos de prueba se seleccionan de tejidos u órganos de los organismos de prueba, en donde los organismos de prueba se seleccionan del grupo que consiste de organismos de la misma especie como el organismo de interés y el organismo que se relaciona con el organismo de interés: y (b) reemplazar el primer codón con el codón sinónimo para construir el polinucleótido sintético, en donde el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por el polinucleótido progenitor que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido

Un método para optimizar expresión génica utilizando optimización de codón sinónimo.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona de manera general con la expresión génica. Más particularmente, la presente invención se relaciona con un método para modular la calidad de un fenotipo seleccionado que se exhibe por un organismo o parte del mismo y que resulta de la expresión de un polinucleótido que codifica el polipéptido al reemplazar por lo menos un codón de tal polinucleótido con un codón sinónimo que tiene una mayor o menor preferencia de uso por el organismo o parte del mismo para producir el fenotipo seleccionado que el codón reemplaza. Aún más particularmente, la invención se relaciona con el uso de un polinucleótido que codifica proteína cuya composición de codón se ha modificado para modular la calidad de un fenotipo seleccionado exhibido por un organismo o parte del mismo.

Antecedente de la invención

La expresión génica heteróloga externa en células transformadas es algo corriente. Un gran número de genes de mamíferos, que incluyen, por ejemplo, genes de murino y humano, se han expresado de forma exitosa en varias células anfitrionas, que incluyen células anfitrionas de bacterias, levadura, insecto, planta y mamífero. No obstante, a pesar del creciente conocimiento de los sistemas de expresión y la tecnología del ADN recombinante, permanecen obstáculos significativos cuando se intenta expresar un gen externo o sintético en una célula anfitriona seleccionada. Por ejemplo, la traducción de un gen sintético, aún cuando se acopla con un promotor fuerte, que a menudo procede mucho más lentamente de lo esperado. Lo mismo es frecuentemente cierto de los genes exógenos que son externos a la célula anfitriona. Esta es menor que la eficiencia de traducción esperada que se debe frecuentemente a las regiones de codificación de proteína del gen que tienen un patrón de uso de codón que no se asemeja a aquellos de los genes altamente expresados en la célula anfitriona. Se sabe a este respecto que la utilización de codón es altamente sesgada y varía considerablemente en diferentes organismos y que los sesgos en el uso del codón pueden alterar los índices de alargamiento del péptido. También se sabe que los patrones de uso de codones están relacionados con la abundancia relativa de isoaceptores de tARN, y que los genes que codifican proteínas de alta abundancia versus baja abundancia muestran las diferencias en sus preferencias de codón.

Las implicaciones del fenómeno de preferencia de codón sobre la expresión génica se manifiestan en que estos fenómenos pueden afectar la eficiencia traducional del ARN mensajero (mARN). Es ampliamente conocido a este respecto que la traducción de "codones raros", para los que el iso-tARN correspondiente es bajo en abundancia con relación a otros iso-tARNs, pueden originar un ribosoma para pausa durante la traducción que puede conducir a una falla para completar una cadena de polipéptido naciente y un desacoplamiento de la trascripción y traducción. Así, la expresión de un gen exógeno se puede impedir severamente si una célula anfitriona particular de un organismo o del organismo en si mismo tiene una baja abundancia de iso-tARNs que corresponde a uno o más codones del gen exógeno. De acuerdo a lo anterior, un objetivo principal de los investigadores en este campo es discernir primero la preferencia del codón para células particulares en las que un gen exógeno se va a expresar, y posteriormente alterar la composición del codón de ese gen para expresión optimizada en aquellas células.

La WO98/12207 describe métodos y genes para expresión de alto nivel de proteínas. La WO01/66739 describe un cADN que codifica un gen TRAG (TGF-ß gen asociado a la resistencia) y su producto de proteína. La US-A-5 689 052 describe secuencias de ADN sintético que tienen expresión mejorada en plantas monocotiledóneas y un método para la preparación de las mismas.

Se conocen técnicas para optimización de codón para mejorar las técnicas traduccionales de regiones de codificación de proteína traduccionalmente ineficientes. Tradicionalmente, estas técnicas se han basado en el remplazo de codones que se utilizan rara o poco frecuentemente en la célula anfitrión con aquellos que son anfitriones preferidos. Las frecuencias de codón se pueden derivar de fuentes de bibliografía para genes altamente expresados de muchos organismos (ver, por ejemplo, Nakamura et al., 1996, Nucleic Acids Res 24: 214-215). Estas frecuencias se expresan generalmente sobre una "base promedio cumplida de organismos" como el porcentaje de ocasiones que se utiliza un codón sinónimo para codificar un aminoácido correspondiente a través de una colección de genes que codifican proteínas de su organismo, que preferiblemente se expresan enormemente.

Típicamente, los codones se clasifican como: (a) codones "comunes" (o codones "preferidos") si su frecuencia de uso está por encima de aproximadamente 4/3 x la frecuencia de uso que se esperaría en la ausencia de cualquier sesgo en el uso de codón; (b) codones "raros" (o codones "no preferidos") si su frecuencia de uso está por debajo de aproximadamente 2/3 x la frecuencia de uso que se esperaría en la ausencia de cualquier sesgo en el uso de codón; y (c) codones "intermedio" (o codones "menos preferidos" ) si su frecuencia de uso está entre la frecuencia de uso de los codones "comunes" y de los codones "raros". Debido a que un aminoácido se puede codificar mediante 2, 3, 4 o 6 codones, la frecuencia de uso de cualquier codón seleccionado, que se esperaría en la ausencia de cualquier sesgo en el uso de codón, dependería del número de codones sinónimos que codifican los mismos aminoácidos como el codón seleccionado. De acuerdo con lo anterior, para un aminoácido particular, el lumbral de frecuencia para clasificar codones en las categorías "común", "intermedio" y "raro" dependería del número de codones sinónimos para ese aminoácido. Por consiguiente, para los aminoácidos que tienen 6 elecciones de codones sinónimos, la frecuencia de uso de codón que se esperaría en la ausencia de cualquier sesgo en el uso de codón es 16% y Así los codones "común", "intermedio" y "raros" se definen como aquellos codones que tienen una frecuencia de uso por encima de 20%, entre 10 y 20% y por debajo de 10%, respectivamente. Para los aminoácidos que tienen 4 elecciones de codones sinónimos, la frecuencia de uso de codón que se esperaría en la ausencia del sesgo del uso de codón es 25% y Así los codones "común", "intermedio" y "raros" se definen como aquellos codones que tienen una frecuencia de uso por encima de del 33%, entre 16 y 33% y por debajo del 16%, respectivamente. Para la isoleucina, que es el único aminoácido que tiene 3 elecciones de codones sinónimos, la frecuencia de uso del codón que se esperaría en la ausencia de cualquier sesgo en el uso de codón es 33% y Así los codones "común", "intermedio" y "raros" para la isoleucina se definen como aquellos codones que tienen una frecuencia de uso por encima de 45%, entre el 20 y 45% y por debajo del 20%, respectivamente. Para los aminoácidos que tienen 2 elecciones de codones sinónimos, la frecuencia de uso de codón que se esperaría en la ausencia del sesgo del uso de codón es del 50% y Así los codones "común", "intermedio" y "raros" se definen como aquellos codones que tienen una frecuencia de uso por encima de 60%, entre 30 y 60% y por debajo del 30%, respectivamente. Así, la categorización de los codones en las clases "común", "intermedio" y "raro" (o "preferidos", "menos preferidos" o "no preferidos", respectivamente) se han basado convencionalmente sobre una compilación de uso de codón para un organismo en general (por ejemplo, "a escala humana") o para una clase de organismos en general (por ejemplo, "a nivel de mamíferos"). Por ejemplo, se puede hacer referencia a Verd (véase Patente Estadounidense Nos de Serie 5,786,464 y 5,795,737) que describen codones preferidos, menos preferidos y no preferidos para células de mamífero en general. Sin embargo, el presente inventor revela en la WO 99/02694 y en WO 00/42190 que hay sustanciales diferencias en la abundancia relativa del iso-tARNs particular en diferentes células o tejidos de un único organismo multicelular (por ejemplo, un mamífero o una planta) y que este tiene un papel vital en la traducción de proteína de una secuencia de codificación con una composición o uso de codón dado.

Así, en contraste con la presunción reconocida por la técnica que las distintas células de un organismo multicelular tienen el mismo sesgo en el uso de codón se revela por primera vez que un tipo...

1. Un método para construir un polinucleótido sintético del cual se puede producir un polinucleótido para conferir un fenotipo seleccionado sobre un organismo multicelular de interés o parte del mismo en una calidad diferente que aquella conferida por un polinucleótido progenitor que codifica el mismo polipéptido, el método comprende: (a) seleccionar un primer codón del polinucleótido progenitor para sustitución con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo se selecciona sobre la base de que este exhibe a una preferencia fenotípica diferente a aquella del primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas en organismos de prueba no humanos o partes de los mismos, en donde las partes de los organismos de prueba se seleccionan de tejidos u órganos de los organismos de prueba, en donde los organismos de prueba se seleccionan del grupo que consiste de organismos de la misma especie como el organismo de interés y el organismo que se relaciona con el organismo de interés: y (b) reemplazar el primer codón con el codón sinónimo para construir el polinucleótido sintético, en donde el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por el polinucleótido progenitor que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las preferencias fenotípicas de codones en los organismos de prueba o partes se comparan al: (i) introducir separadamente en los organismos o partes de prueba construcciones sintéticas individuales, cada una de las cuales comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem de un codón fusionado en un marco con un polinucleótido indicador que codifica una proteína reportera, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo correspondiente seleccionado del grupo que consiste del fenotipo seleccionado y un fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado; y (ii) comparar la calidad del fenotipos exhibidos por los organismos de prueba o partes para determinar las preferencias relativas fenotípicas de los codones.

3. Un método para construir un polinucleótido sintético del cual se puede producir un polinucleótido para conferir un fenotipo seleccionado sobre un organismo multicelular de interés o parte del mismo en una calidad diferente que aquella conferida por un polinucleótido progenitor que codifica el mismo polipéptido, el método comprende: (a) seleccionar un primer codón del polinucleótido progenitor para sustitución con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo se selecciona sobre la base de que este exhibe una preferencia fenotípica diferente de aquella del primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas partes ex vivo de organismos de prueba, en donde dichas partes de organismos de prueba se seleccionan de tejidos u órganos de los organismos de prueba, en donde dichas partes de organismos de prueba no incluyen un citoblasto embriónico humano o una estirpe celular germinal, en donde las partes de organismos de prueba se seleccionan del grupo que consiste de organismos de la misma especie como el organismo de interés y organismos que se relacionan con el organismo de interés: y (b) reemplazar el primer codón con el codón sinónimo para construir el polinucleótido sintético, en donde el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por el polinucleótido progenitor que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las preferencias fenotípicas de codones en las partes de organismos de prueba se comparan al: (i) introducir separadamente en las partes ex vivo de organismos de prueba individual construcciones sintéticas, cada una de las cuales comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem de un codón fusionado en un marco con un polinucleótido indicador que codifica una proteína reportera, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo correspondiente seleccionado del grupo que consiste del fenotipo seleccionado y un fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado; y (ii) comparar la calidad del fenotipos exhibidos por las partes ex vivo de los organismos de prueba para determinar las preferencias relativas fenotípicas de los codones.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en donde la proteína reportero produce el fenotipo seleccionado.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en donde el reportero no produce el fenotipo seleccionado pero produce la misma clase de fenotipo como el fenotipo seleccionado.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 o reivindicación 6, en donde la proteína reportero se selecciona de antígenos derivados de organismos patogénicos, antígenos de cáncer, autoantígenos, antígenos de trasplante, factores de crecimiento, hormonas y toxinas.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el fenotipo se selecciona de inmunidad, tolerancia a antígeno, angiogenia, anti-angiogenia, alivio de síntomas clínicos, muerte celular incrementada o reducida, diferenciación celular incrementada o reducida, proliferación celular incrementada o reducida, regresión de tumor o cáncer, crecimiento y reparación de tejido o órgano, fibrosis disminuida, inhibición o reversión de la senescencia celular, migración celular incrementada o reducida, expresión diferencial de proteínas entre las diferentes células o tejidos de un organismo o parte del mismo, recuperación de trauma, recuperación de quemaduras, resistencia o sensibilidad a los antibióticos, tolerancia o sensibilidad a herbicidas, biosíntesis o modificación del almidón, biosíntesis de ácidos grasos, resistencia o tolerancia a enfermedades, resistencia o tolerancia a las plagas que incluyen resistencia o tolerancia a insectos, resistencia o tolerancia vírica, resistencia o tolerancia a los hongos, una característica metabólica incluye el metabolismo de la sacarosa, resistencia o tolerancia a las heladas, tolerancia al estrés, y contenido de alimentos mejorado o rendimientos incrementados.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el fenotipo es una respuesta inmune.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la respuesta inmune es una repuesta inmune humoral.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la respuesta inmune es una repuesta inmune mediada por célula.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la respuesta inmune es una repuesta mediada por inmunidad innata.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 4, en donde las construcciones sintéticas se introducen en los organismos de prueba no humanos utilizando el mismo o similar modo de introducción.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 4, en donde las construcciones sintéticas se introducen en los organismos de prueba no humanos en el mismo o sitio correspondiente.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el organismo de interés es un mamífero no humano y las construcciones sintéticas se introducen por ruta oral, intravenosa, intramuscular, intranasal, bucal, subcutánea, transdérmica, bucal o sublingual.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las construcciones sintéticas se introducen en uno o más de los tipos de célula o tejido del organismo de interés.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde las construcciones sintéticas se introducen en células seleccionadas de células de músculo, células de piel, células de cerebro, células de pulmón, células de riñón, células de páncreas, células de un órgano reproductor, células de corazón, células vasculares, células de hígado, células de ojo, células de flores, células del meristemo, células de la raíz y células de la hoja.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las construcciones sintéticas se introducen en uno o más tipos de tejido o célula ex vivo del organismo de interés en donde dichos tipos de célula o tejido no incluyen un citoblasto embriónico humano o una estirpe celular germinal.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la célula en la que las construcciones sintéticas se introducen se seleccionan de células de músculo, células de piel, células de cerebro, células de pulmón, células de riñón, células de páncreas, células de un órgano reproductor, células de corazón, células vasculares, células de hígado, células de ojo, células de flores, células del meristemo, células de la raíz y células de la hoja.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en donde la repetición tándem de cada una de las construcciones sintéticas comprende por lo menos tres copias del codón correspondiente.

21. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el codón sinónimo se selecciona de tal manera que este tiene una preferencia fenotípica mayor que el primer codón.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el codón sinónimo se selecciona cuando la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética comprende una repetición tándem del codón sinónimo es por lo menos aproximadamente 5% mayor que la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón.

23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el codón sinónimo se selecciona de tal manera que tiene una menor preferencia fenotípica que el primer el primer codón.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el codón sinónimo se selecciona cuando la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética comprende una repetición tándem del codón sinónimo es por lo menos aproximadamente 5% más baja que la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón.

25. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el organismo multicelular es un animal.

26. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el organismo multicelular es un mamífero.

27. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el organismo multicelular es una planta.

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las construcciones sintéticas se introducen en los progenitores de los organismos de prueba no humanos o partes y los progenitores se hacen crecer o se cultivan durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para producir los organismos de prueba o partes, por lo cual las construcciones sintéticas están contenidas en uno o más tipos celulares de aquellos organismos o partes.

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde las células progenitoras se seleccionan de citoblastos, células pluripotenciales, células del meristemo y callo embriónico.

30. Un método para determinar la preferencia fenotípica de un primer codón en un organismo multicelular de interés o parte del mismo, el método comprende: (a) introducir una construcción sintética en un organismo de prueba no humano o parte del mismo, en donde dicha parte de un organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde el organismo de prueba se selecciona del grupo que consiste de un organismo de la misma especie como el organismo de interés y un organismo que se relaciona con el organismo de interés, la construcción sintética comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem del primer codón fusionado en el marco con un polinucleótido indicador que codifica una proteína reportera, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo seleccionado o un fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado; y (b) determinar la calidad del fenotipo correspondiente exhibido por el organismo de prueba no humano o parte, en donde el fenotipo seleccionado o el fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por el polinucleótido progenitor que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

31. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, comprende adicionalmente: comparar (i) la calidad del fenotipo correspondiente exhibida por un organismo de prueba no humano o parte del mismo al cual se proporciona una construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón; y (ii) la calidad del fenotipo correspondiente exhibida por un organismo de prueba no humano o parte del mismo al que se proporciona una construcción sintética que comprende una repetición tándem de un segundo codón, en donde el segundo codón codifica el mismo aminoácido como el primer codón, por lo cual determina la preferencia fenotípica del primer codón relativo a la preferencia fenotípica del segundo codón en el organismo de prueba o parte.

32. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, comprende adicionalmente: (1) introducir la construcción sintética en un progenitor de un organismo de prueba no humano o parte del mismo; y (2) producir el organismo de prueba o parte del progenitor en donde el organismo de prueba o parte contiene la construcción sintética.

33. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, comprende adicionalmente: (1) introducir la construcción sintética en un progenitor de un organismo de prueba no humano o parte del mismo; y (2) hacer crecer el organismo de prueba o parte del progenitor; en donde el organismo de prueba o parte comprende una célula que contiene la construcción sintética.

34. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, comprende adicionalmente: introducir la construcción sintética en una célula seleccionada del organismo de prueba no humano o parte.

35. Un método para determinar la preferencia fenotípica de un primer codón en un organismo multicelular de interés o parte del mismo, el método comprende: (a) introducir una construcción sintética en una parte ex vivo de un organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba no incluye un citoblasto embriónico humano o una estirpe celular germinal, en donde la parte de un organismo de prueba se selecciona del grupo que consiste de un organismo de la misma especie como el organismo de interés y un organismo que se relaciona con el organismo de interés, la construcción sintética comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem del primer codón fusionado en el marco con un polinucleótido indicador que codifica una proteína reportera, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo seleccionado o un fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado; y (b) determinar la calidad del fenotipo correspondiente exhibida por la parte ex vivo de un organismo de prueba, en donde el fenotipo seleccionado o el fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por el polinucleótido progenitor que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

36. Un método de acuerdo con la reivindicación 35, comprende adicionalmente: comparar (i) la calidad del fenotipo correspondiente exhibida por una parte ex vivo de un organismo de prueba al que se proporciona una construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón, en donde dicha parte de un organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba no incluye un citoblasto embriónico humano o una estirpe celular germinal; y (ii) la calidad del fenotipo correspondiente exhibida por una parte ex vivo de un organismo de prueba al cual se proporciona una construcción sintética que comprende una repetición tándem de un segundo codón, en donde dicha parte de un organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba no incluye un citoblasto embriónico humano o una estirpe celular germinal, en donde el segundo codón codifica el mismo aminoácido como el primer codón, por lo cual determina preferencia fenotípica del primer codón relativa a la preferencia fenotípica del segundo codón en el organismo de prueba o parte.