PRODUCCION FOTOSINTETICA DE HIDROGENO.

Un microorganismo fotosintético de Chlamydomonas spp. que tiene capacidad de transporte de electrones por reacción fotosintética "light" y por una cadena respiratoria de transporte de electrones que implica un camino de fosforilación oxidante,

y que expresa una hidrogenasa, en donde la actividad de un factor de transcripción mitocondrial Moc1 que regula la cadena respiratoria de transporte de electrones se reduce o se elimina con el resultado de que el flujo de electrones a lo largo de la cadena respiratoria de transporte de electrones hacia la citocromo-oxidasa (complejo IV) se reduce

Producción fotosintética de hidrógeno.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la producción de hidrógeno y, más particularmente, a la mejora de la producción de hidrógeno en microorganismos fotosintéticos con capacidad natural de producción de hidrógeno. En particular, la invención se refiere a microorganismos fotosintéticos, que incluyen cianobacterias y algas que son capaces de producir hidrógeno a partir del agua utilizando una hidrogenasa. La invención está relacionada también con la manipulación de la fisiología de tales organismos para mejorar la producción de hidrógeno.

Técnica anterior

El desarrollo de una energía limpia, sostenible y económicamente viable para el futuro es uno de los retos más urgentes de la presente generación. Se espera que la producción de petróleo alcance el máximo en aproximadamente 5 a 30 años y las reservas económicamente viables de petróleo se agoten en gran parte hacia 2050. Informes más recientes, sin embargo, sugieren que la producción de petróleo puede haber alcanzado ya el máximo en el año 2000. Una economía viable basada en hidrógeno requiere vías limpias, sostenibles y económicas de generación de hidrógeno. La producción actual de hidrógeno depende casi totalmente del uso de recursos no renovables (a saber la reformación con vapor del gas natural, la gasificación del carbón y la electrólisis del agua impulsada por energía nuclear). Aunque es verosímil que estos enfoques impulsen inicialmente una transición hacia una economía basada en hidrógeno, el hidrógeno producido es más caro y contiene menos energía que la fuente de energía no renovable de la que se deriva. Adicionalmente, el uso de combustibles fósiles y energía nuclear es insostenible. Por esta razón, existe una necesidad evidente de establecer medios económicamente viables de producción de hidrógeno.

Una opción particularmente deseable es la producción de hidrógeno utilizando organismos fotosintéticos, dado que la fuente última de energía es la energía solar. La tecnología de los estanques de algas es probablemente barata comparada con alternativas tales como las pilas fotovoltaicas. Adicionalmente, en contraste con todos los restantes sistemas de energía sostenibles (excepto la biomasa), que incurren en penalización inicial por emisiones de CO₂ durante la fabricación, las algas tienen la ventaja de que son capaces de secuestrar CO₂ mientras autoensamblan sus intrincados colectores solares. Esto aporta a las mismas un valor intrínseco adicional en términos de intercambio de carbono durante el establecimiento.

La energía solar es capturada y almacenada en la forma de almidón y otras moléculas que incluyen proteínas, que se utilizan subsiguientemente como combustible para impulsar la producción de ATP por los procesos de fosforilación oxidante en las mitocondrias (Fig. 1). Algunas algas verdes han desarrollado la capacidad de canalizar los H⁺ y e^- almacenados en el almidón hacia la producción de H₂ en condiciones anaerobias. Así, esto hace concebir esperanzas de que pueda generarse hidrógeno utilizando biorreactores de algas. En el primer paso de la fotosíntesis, el Fotosistema II (PSII) impulsa la reacción más fuertemente oxidante que se sabe tiene lugar en biología, consistente en la disociación de H₂O en oxígeno (O₂), protones (H⁺) y electrones (e^-) (Fig. 1). El O₂ se libera a la atmósfera y es responsable del mantenimiento de la vida aerobia en la Tierra. Los e^- derivados pasan a lo largo de la cadena fotosintética de transporte de e^- (Fig. 2) desde PSII pasando por plastoquinona (PQ) a Citocromo b₆f (cyt b₆f) y el Fotosistema I (PSI), y se utilizan finalmente en la producción de NADPH. En un proceso paralelo (fotofosforilación), se liberan H⁺ al lumen de los tilacoides (Fig. 1) donde los mismos generan un gradiente de H⁺ que se utiliza para impulsar la producción de ATP por la ATP-sintasa. Ulteriormente, se utilizan NADPH y ATP para producir almidón y otras biomoléculas.

ATP y NADPH/NADH son requisitos fundamentales de todas las células vivas. La inhibición de PSII (v.g. por incubación en la oscuridad) bloquea el suministro de H⁺ y e^- que se utilizan para generar ATP y NADPH por fotofosforilación en el cloroplasto. Durante algún tiempo, el déficit de ATP y NADPH causado por la inhibición de PSII puede ser compensado por la respiración aerobia mediada por la cadena mitocondrial de transporte de e^- (Fig. 1), que metaboliza almidón, proteínas y lípidos. Como lo sugiere su nombre, la fosforilación oxidante requiere O₂. El O₂ se combina con H⁺ y e^- por el Complejo mitocondrial IV para generar H₂O, que actúa esencialmente como un sumidero de H⁺ y e^- (Fig. 1). En condiciones anaerobias, el Complejo IV está inhibido, bloqueando el transporte de e^- por el resto de la cadena de transporte de e^- constituida por los Complejos I, II, III, y la Citocromo-oxidasa (conocida también como Complejo IV). En condiciones estrictamente anaerobias, la mayoría de los organismos fotosintéticos mueren. Sin embargo, un número seleccionado de organismos fotosintéticos tales como el alga verde C. reinhardtii dispone de un tercer mecanismo, que les permite cambiar a un modo de producción de ATP y NADPH (Fig. 2). En condiciones anaerobias iluminadas, dichos organismos generan ATP en el cloroplasto al tiempo que producen simultáneamente H₂ como un sumidero volátil de H⁺/e^-, en lugar de H₂O. Este proceso implica la hidrogenasa HydA localizada en el estroma del cloroplasto (Florin et al., 2001 y Happe y Kaminski, 2002.). La transcripción y actividad de HydA es inhibida fuertemente por O₂ (Ghirardi et al., 1997). Es verosímil que la sensibilidad al oxígeno actúe como conmutador molecular de control que informa a HydA cuándo existen condiciones anaerobias.

A fin de optimizar la producción de ATP Y NADPH en condiciones transitorias de luz, las plantas y las algas han desarrollado un mecanismo de regulación controlado por rédox denominado las transiciones de estado LHC. Este proceso equilibra normalmente las tasas de renovación de PSI y PSII por regulación del tamaño de sus antenas colectoras de luz (LHCI & LHCII, respectivamente), específicamente por transporte de las proteínas Lhcb entre los dos fotosistemas (Estado 1: antenas grandes PSII; Estado 2: antenas grandes PSI). En el alga verde C. reinhardtii, este proceso da como resultado un cambio de transporte fotosintético de electrones lineal a cíclico, que podía competir con la Fe-hidrogenasa HydA por e^- en el lado reductor de PSI. Las células bloqueadas en estado 1 en condiciones anaerobias no realizan el transporte cíclico de electrones en el cual los electrones son transferidos de nuevo a Cytb₆f. En estas condiciones, la Fe-hidrogenasa HydA ya no tiene que competir con el transporte cíclico de electrones mediado por Cytb₆f para los electrones derivados de PSI.

Los primeros informes de la producción de H₂ por algas se remontan a los años 1930 (Stephenson y Stickland, 1931). Se descubrió que ciertas algas verdes y cianobacterias podrían producir H₂ gaseoso por iluminación, por una reacción que era extremadamente sensible a la inhibición por O₂. A pesar del evidente atractivo de la utilización de organismos fotosintéticos para la producción sostenible de H₂ a partir del agua, no fue hasta 2000 que Melis y colaboradores publicaron por primera vez un método para vencer esta inhibición (Melis, 2000 y Solicitud de Patente EE.UU. No. 2001/005343). Melis describe un proceso en el cual la inhibición era levantada por separación temporal de la reacción de disociación del agua generadora de O₂, catalizada por PSII, de la producción de H₂ sensible a O₂ catalizada por la hidrogenasa de los cloroplastos (HydA). Esta separación se conseguía por cultivo de C. reinhardtii primeramente en presencia de azufre para construir almacenes de un sustrato endógeno y luego en ausencia de azufre. El azufre es requerido para la síntesis de novo de la proteína D1 del centro de reacción PSII, y por supuesto de muchos otros componentes orgánicos de la célula. La proteína D1 tiene una semivida aproximada de 30 min, deteriorándose en condiciones no óptimas por la reacción fuertemente oxidante que impulsa la misma. En...

1. Un microorganismo fotosintético de Chlamydomonas spp. que tiene capacidad de transporte de electrones por reacción fotosintética "light" y por una cadena respiratoria de transporte de electrones que implica un camino de fosforilación oxidante, y que expresa una hidrogenasa, en donde la actividad de un factor de transcripción mitocondrial Moc1 que regula la cadena respiratoria de transporte de electrones se reduce o se elimina con el resultado de que el flujo de electrones a lo largo de la cadena respiratoria de transporte de electrones hacia la citocromo-oxidasa (complejo IV) se reduce.

2. El microorganismo fotosintético de la reivindicación 1, en el cual dicho microorganismo es Chlamydomonas reinhardtii.

3. El microorganismo fotosintético de la reivindicación 2 en donde dicho microorganismo es Chlamydomonas reinhardtii Stm6 depositado en la Colección de Cultivos de Algas y Protozoos (CCAP) en fecha 1 de julio de 2003 bajo el número de acceso CCAP11/129.

4. Un cultivo sustancialmente puro de un microorganismo que comprende el microorganismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un proceso para la producción de hidrógeno que comprende los pasos de:

(i) proporcionar un microorganismo fotosintético de Chlamydomonas spp. como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

(ii) cultivar el microorganismo en condiciones microóxicas e iluminadas; y

(iii) recoger el hidrógeno desprendido.

6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual el microorganismo se cultiva en medio que contiene acetato.

7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual la fuente de carbono es dióxido de carbono.

8. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en el cual la iluminación se continúa durante hasta 120 horas.

9. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 en el cual la eliminación es por radiación solar.

10. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el cual la iluminación es por una fuente de luz artificial.

11. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el cual la iluminación tiene lugar con una intensidad de luz comprendida entre 15 y 3100 µmol m^-2 s^-1.

12. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, que comprende adicionalmente añadir un desacoplador de ATP-sintasa procedente de la cadena fotosintética de transporte de electrones.

13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual el desacoplador se selecciona del grupo constituido por carbonil-cianuro-3-cloro-fenilhidrazona (CCCP), 1,3-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC), cloruro de amonio, Venturicidina, carbonil-cianuro-p-trifluoro-metoxifenilhidrazona (FCCP), 2,4-dinitrofenol, Gramicidina y Nigericina.

14. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13 en el cual la actividad del factor de transcripción mitocondrial Moc1 se reduce o elimina por introducción de una molécula antisentido, utilizando RNAi, por introducción de una mutación desactivadora, o por introducción de un inhibidor del factor de transcripción mitocondrial.

15. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, en el cual el alga es Chlamydomonas reinhardtii.

16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 15, en el cual el alga es Chlamydomonas reinhardtii Stm6, depositada en la Colección de Cultivo de Algas y Protozoos (CCAP) con fecha 1 de julio de 2003 bajo el número de acceso 11/129.