Proteínas de unión a albúmina sérica.

Secuencia de aminoácidos que es una secuencia de inmunoglobulina que puede unirse a la albúmina sérica humana y que consiste en 4 regiones de entramado,

FR1 a FR4 respectivamente, y 3 regiones determinantes de complementariedad, CDR1 a CDR3 respectivamente, en la que:

(i) CDR1 comprende o es la secuencia de aminoácidos SFGMS; CDR2 comprende o es la secuencia de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG; y CDR3 comprende o es la secuencia de aminoácidos GGSLSR y en la que

(ii) la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, incluso más preferiblemente al menos el 99% con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs 52 y 57 a 64; y

(iii) la secuencia de aminoácidos es la secuencia PMP6A6 según SEQ ID NO: 52, o una variante humanizada de la secuencia PMP6A6 según SEQ ID NO: 5

Proteínas de unión a albúmina sérica.

La presente invención se refiere a secuencias de aminoácidos que pueden unirse a albúmina sérica tal como se define en la reivindicación 1, a proteínas y polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en tales secuencias de aminoácidos; a ácidos nucleicos que codifican para tales secuencias de aminoácidos, proteínas o polipéptidos; a composiciones, y en particular a composiciones farmacéuticas, que comprenden tales secuencias de aminoácidos, proteínas y polipéptidos; y a usos de tales secuencias de aminoácidos, proteínas y polipéptidos.

Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención se aclararán a partir de la descripción adicional en el presente documento.

En la técnica se conocen secuencias de aminoácidos que pueden unirse a albúmina sérica humana y usos de las mismas en constructos polipeptídicos con el fin de aumentar la semivida de proteínas y polipéptidos terapéuticamente relevantes.

Por ejemplo, los documentos WO 91/01743, WO 01/45746 y WO 02/076489 describen restos peptídicos que se unen a albúmina sérica que pueden fusionarse a proteínas terapéuticas y a otras entidades y compuestos terapéuticos con el fin de aumentar la semivida de los mismos. Sin embargo, estos restos peptídicos son de origen bacteriano o sintético, que se prefiere menos para su uso en terapéutica.

El documento WO 04/041865 del solicitante describe Nanobodies® dirigidos contra la albúmina sérica (y en particular contra la albúmina sérica humana) que pueden unirse a otras proteínas (tales como uno o más de otros Nanobodies® dirigidos contra una diana deseada) con el fin de aumentar la semivida de dicha proteína.

El receptor de Fc neonatal (FcRn) , también denominado "receptor de Brambell", está implicado en prolongar la vida de la albúmina en circulación (véase Chaudhur y , et al., The Journal of Experimental Medicine, vol. 3, nº 197, 315322 (2003) ) . El receptor FcRn es una glicoproteína integral de membrana que consiste en una cadena ligera soluble que consiste en 12-microglobulina, unida de manera no covalente a una cadena a de 43 kD con tres dominios extracelulares, una región transmembrana y una cola citoplasmática de aproximadamente 50 aminoácidos. La cola citoplasmática contiene una señal de endocitosis basada en un motivo dinucleotídico implicada en la internalización del receptor. La cadena a es un miembro de la familia del CMH I no clásico de proteínas. La asociación de 12m con la cadena a es crítica para el plegamiento correcto de FcRn y la salida del retículo endoplasmático para dirigirse a endosomas y a la superficie celular.

La estructura global de FcRn es similar a la de las moléculas de clase I. Las regiones a-1 y a-2 se asemejan a una plataforma compuesta de ocho cadenas 1 antiparalelas que forman una única lámina 1 coronada por dos hélices a antiparalelas que se asemejan muy estrechamente a la hendidura peptídica en las moléculas de CMH I. Debido a una recolocación global de la hélice a-1 y al curvado de su parte C-terminal de la hélice a-2 debido a una interrupción en la hélice introducida por la presencia de Pro162, las hélices de FcRn están considerablemente más próximas entre sí, ocluyendo la unión peptídica. La cadena lateral de Arg164 de FcRn también ocluye la interacción potencial del extremo N-terminal del péptido con el bolsillo de CMH. Además, un puente salino y la interacción hidrófoba entre las hélices a-1 y a-2 también pueden contribuir al cierre del surco.

Por tanto, el FcR no participa en la presentación de antígenos, y la hendidura peptídico está vacía.

El FcRn se une a y transporta la IgG a través del sincitiotrofoblasto de la placenta desde la circulación materna hasta la circulación fetal y protege a la IgG frente a la degradación en adultos. Además de la homeostasis, el FcRn controla la transcitosis de la IgG en tejidos. El FcRn se ubica en células epiteliales, células endoteliales y hepatocitos.

Según Chaudhur y et al. (citado anteriormente) , la albúmina se une al FcRn para formar un complejo trimolecular con la IgG. Tanto la albúmina como la IgG se unen de manera no cooperativa a distintos sitios en el FcRn. La unión del FcRn humano a Sepharose-HSA y Sepharose-hIgG era dependiente del pH, siendo máxima a pH 5, 0 y nula a de pH 7, 0 a pH 8. La observación de que el FcRn se une a albúmina de la misma forma dependiente del pH en que se une a IgG sugiere que el mecanismo por el que la albúmina interacciona con el FcRn y por tanto se protege frente a la degradación, es idéntico al de la IgG, y está mediado por una interacción con FcRn sensible al pH de manera similar. Usando SPR (surface plasmon resonance, resonancia de plasmón superficial) para medir la capacidad de los dominios individuales de HSA para unirse a hFcRn soluble inmovilizado, Chaudhur y demostró que el FcRn y la albúmina interaccionan a través del dominio D-III de la albúmina de una manera dependiente del pH, en un sitio distinto del sitio de unión a IgG (Chaudhur y , PhD dissertation, véase http://www.andersonlab.com/biosketchCC.htm; Chaudhur y et al. Biochemistr y , ASAP, Artículo 10.1021/bi052628y S0006-2960 (05) 02628-0 (fecha de publicación en la web: 22 de marzo de 2006) ) .

Un objeto de la presente invención es proporcionar secuencias de aminoácidos que constituyan una alternativa, y en particular una alternativa mejorada, a las secuencias de aminoácidos de unión a albúmina descritas en la técnica anterior citada anteriormente.

En un aspecto, la invención logra este objetivo proporcionando secuencias de aminoácidos, que son secuencias de inmunoglobulina tal como se define en la reivindicación 1, y más en particular secuencias de dominio variable de inmunoglobulina, que pueden unirse a o asociarse de otro modo con la albúmina sérica de tal forma que, cuando la secuencia de aminoácidos o constructo polipeptídico se une a o se asocia de otro modo con una molécula de albúmina sérica, la unión de dicha molécula de albúmina sérica al FcRn no se reduce ni inhibe (significativamente) (es decir, en comparación con la unión de dicha molécula de albúmina sérica al FcRn cuando la secuencia de aminoácidos o constructo polipeptídico no se une a la misma) . En este aspecto de la invención, por "no se reduce ni inhibe significativamente" quiere decirse que la afinidad de unión para la albúmina sérica a FcRn (tal como se mide usando un ensayo adecuado, tal como SPR) no se reduce en más del 50%, preferiblemente no se reduce en más del 30%, incluso más preferiblemente no se reduce en más del 10%, tal como que no se reduce en más del 5%, o esencialmente no se reduce en absoluto. En este aspecto de la invención, "no se reduce ni inhibe significativamente" también puede significar (o puede significar adicionalmente) que la semivida de la molécula de albúmina sérica no se reduce significativamente (tal como se define más adelante) .

Cuando en esta descripción se hace referencia a unión, tal unión es preferiblemente unión específica, tal como entiende normalmente el experto.

Cuando una secuencia de aminoácidos tal como se describe en el presente documento es una secuencia de inmunoglobulina monovalente (por ejemplo, un nanocuerpo monovalente) , dicha secuencia de inmunoglobulina monovalente preferiblemente se une a la albúmina sérica humana con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o inferior, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o inferior y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro, y/o con una afinidad de unión de al menos 107 M-l, preferiblemente de al menos 108 M-l, más preferiblemente de al menos 109 M-l, tal como de al menos 1012 M-l. Generalmente se considera que cualquier valor de KD superior a 10-4 litros/mol indica unión no específica. Preferiblemente, una secuencia de inmunoglobulina monovalente de la invención se unirá al antígeno deseado con una afinidad inferior a 500 nM, preferiblemente inferior a 200 nM, más preferiblemente inferior a 10 nM, tal como inferior a 500 pM. La unión específica de una proteína de unión a antígenos a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA) , inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos competitivos de tipo sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas per se en la técnica.

En otro aspecto, la invención proporciona... [Seguir leyendo]

1. Secuencia de aminoácidos que es una secuencia de inmunoglobulina que puede unirse a la albúmina sérica humana y que consiste en 4 regiones de entramado, FR1 a FR4 respectivamente, y 3 regiones determinantes de complementariedad, CDR1 a CDR3 respectivamente, en la que:

(i) CDR1 comprende o es la secuencia de aminoácidos SFGMS; CDR2 comprende o es la secuencia de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG; y CDR3 comprende o es la secuencia de aminoácidos GGSLSR y en la que

(ii) la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, incluso más preferiblemente al menos el 99% con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs 52 y 57 a 64; y

(iii) la secuencia de aminoácidos es la secuencia PMP6A6 según SEQ ID NO: 52, o una variante humanizada de la secuencia PMP6A6 según SEQ ID NO: 52.

2. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1, que es una variante humanizada de la secuencia PMP6A6 según SEQ ID NO: 52.

3. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 2, que se elige del grupo que comprende los clones ALB 3 según SEQ ID NO: 57; ALB 4 según SEQ ID NO: 58; ALB 5 según SEQ ID NO: 59; ALB 6 según SEQ ID NO: 60; ALB 7 según SEQ ID NO: 61; ALB 8 según SEQ ID NO: 62; ALB 9 según SEQ ID NO: 63; y ALB 10 según SEQ ID NO: 64.

4. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 3, que es ALB 8 según SEQ ID NO: 62.

5. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1 ó 2, que es un nanocuerpo o un anticuerpo de un solo dominio.

6. Constructo o proteína de fusión, que comprende una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y al menos un resto terapéutico.

7. Constructo o proteína de fusión según la reivindicación 6, en el que la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o bien se une directamente al al menos un resto terapéutico o bien se une al al menos un resto terapéutico a través de un ligador o espaciador.

8. Constructo o proteína de fusión según la reivindicación 6 ó 7, en el que el resto terapéutico comprende una secuencia de inmunoglobulina o un fragmento de la misma.

9. Constructo o proteína de fusión según la reivindicación 8, en el que el resto terapéutico comprende un anticuerpo de dominios, preferiblemente un anticuerpo de un solo dominio.

10. Constructo de nanocuerpo multivalente y multiespecífico, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que es un nanocuerpo y al menos un nanocuerpo adicional.

11. Constructo de nanocuerpo multivalente y multiespecífico según la reivindicación 10, en el que la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que es un nanocuerpo o bien se une directamente al al menos un nanocuerpo adicional o bien se une al al menos un nanocuerpo adicional a través de un ligador o espaciador.

12. Constructo de nanocuerpo multivalente y multiespecífico según la reivindicación 11, en el que la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que es un nanocuerpo se une al al menos un nanocuerpo adicional a través de un ligador o espaciador, y en el que el ligador es una secuencia de aminoácidos.

13. Secuencia de nucleótidos o ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos, constructo o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. Huéspedes o células huésped que contienen una secuencia de nucleótidos o ácido nucleico según la reivindicación 13, y/o que expresan, o pueden expresar, una secuencia de aminoácidos, constructo o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

15. Método para preparar una secuencia de aminoácidos, constructo o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, comprendiendo el método cultivar o mantener una célula huésped tal como se describe en el presente documento en condiciones tales que dicha célula huésped produce o expresa una secuencia de aminoácidos, constructo o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, y opcionalmente comprende además aislar la secuencia de aminoácidos, constructo o proteína de fusión así producido.

16. Composición farmacéutica que comprende al menos una secuencia de aminoácidos, constructo o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, y opcionalmente al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

17. Uso de una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como pareja de fusión con el fin de aumentar la semivida de restos terapéuticos.

18. Método de aumento de la semivida de un resto terapéutico que comprende usar una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como pareja de fusión.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Ablynx N.V.

<120> Proteínas de unión a albúmina sérica <130> P 06-008 PCT

<160> 64

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 30

<212> PRT 15 <213> Artificial <400> 1

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial <400> 2

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial <400> 3

<210> 4

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<212> PRT

<213> Artificial <400> 4

<210> 6

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<210> 7

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<210> 34

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<213> Artificial <400> 40

<210> 41

<211> 5

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<213> Artificial <400> 41 <210> 42

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial <400> 42

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial <400> 43

<210> 44

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<213> Artificial <400> 50

<210> 51

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<212> PRT

<213> Artificial <400> 51

<210> 52

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial <400> 52

<210> 53

<211> 116

<212> PRT

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<210> 54

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial <400> 54

<210> 55

<211> 114

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<213> Artificial <400> 55

<210> 56

<211> 123

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<210> 57

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial <400> 57

<210> 58

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<212> PRT

<213> Artificial <400> 58

<210> 59

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<212> PRT

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<210> 60

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial <400> 60

<210> 61

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial <400> 61

<210> 62

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial <400> 62

<210> 63

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial <400> 63

<210> 64

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial <400> 64