Proteína de fusión de Fc-eritropoyetina con farmacocinética mejorada.

Una proteína de fusión dimérica purificada que consiste, esencialmente,

en una porción Fc dimérica de unamolécula de IgG humana, que comprende una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, y eritropoyetinahumana (EPO), en donde cada cadena de la porción Fc dimérica está ligada por su C-terminal al N-terminal de unamolécula de EPO,

en donde dicha proteína de fusión Fc-EPO es producida en células BHK-21 en un medio libre de proteínas, y esseleccionada del grupo que consiste en:

(i) Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO como se muestra mediante SEQ ID No. 14; y

(ii) Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO(NDS) como se muestra mediante SEQ ID No. 15.

Proteína de fusión de Fc-eritropoyetina con farmacocinética mejorada.

Área de la invención.

La presente invención proporciona, en general, novedosas proteínas de fusión altamente sialiladas con farmacocinética mejorada. De manera específica, las proteínas Fc-EPO presentan una vida media en suero prolongada y una potencia in vivo aumentada. Las proteínas de fusión Fc-EPO sintetizadas en células BHK han prolongado su vida media en suero y han aumentado su potencia in vivo de manera espectacular, en comparación con las proteínas de fusión Fc-EPO correspondientes producidas en otras líneas celulares, tales como, por ejemplo, células NS/0. La presente invención hace referencia además a proteínas Fc-EPO, en donde se han realizado una serie de modificaciones en la porción Fc-además de en la porción EPO, a fin de obtener respectivas moléculas con propiedades adicionalmente mejoradas.

Antecedentes.

La eritropoyetina es una hormona glicoproteica necesaria para la maduración de células progenitoras en eritrocitos. Se produce en el riñón y es esencial en la regulación de los niveles de glóbulos rojos en la circulación. Las condiciones marcadas por niveles bajos de la señal de oxígeno en los tejidos aumenta la producción de eritropoyetina, lo que a su vez estimula la eritropoyesis. El nivel de eritropoyetina en la circulación es regulado de manera estricta, para asegurar que los glóbulos rojos sean producidos únicamente en respuesta a un déficit de oxígeno prolongado. El 70% de la eritropoyetina se elimina mediante endocitosis mediada por receptor. Cuando la eritropoyetina se une a su receptor, el complejo es endocitado y degradado, limitando de esa forma el grado de señalización. Los restos de eritropoyetina que quedan se eliminan mediante la filtración del riñón por la orina. Como resultado, la eritropoyetina tiene una vida media en suero relativamente corta.

La eritropoyetina humana natural o recombinante producida en células de mamíferos contiene tres cadenas de oligosacáridos N-ligadas y una O-ligada. La glicosilación N-ligada tiene lugar en residuos asparagina situados en las posiciones 24, 38 y 83, mientras que la glicosilación O-ligada tiene lugar en un residuo serina situado en la posición 126 (Lai et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:3116; Broudy et al., (1988) Arch. Biochem. Biophys. 265:329) . Se ha demostrado que las cadenas de oligosacáridos se modifican con residuos terminales de ácido siálico. Las cadenas N-ligadas presentan, de manera habitual, hasta cuatro ácidos siálicos por cadena y las cadenas O-ligadas presentan hasta dos ácidos siálicos. Un polipéptido de eritropoyetina puede, por tanto, alojar un total de hasta 14 ácidos siálicos. Se ha demostrado que se requiere el carbohidrato para la secreción de la eritropoyetina por parte de las células, para aumentar la solubilidad de la eritropoyetina, y para la actividad biológica de la eritropoyetina in vivo (Dube et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:17516; DeLorme et al., (1992) Biochemistr y 31:9871-9876) .

La administración de la eritropoyetina humana recombinante ha resultado efectiva en el tratamiento de trastornos o deficiencias hematopoyéticos, tales como, por ejemplo, diferentes formas de anemia, incluyendo aquellas asociadas al fallo renal, a la infección por VIH, la pérdida de sangre y la enfermedad crónica. La eritropoyetina se administra, habitualmente, por inyección intravenosa. Debido a que la eritropoyetina tiene una vida media en suero relativamente corta, se requieren frecuentes inyecciones intravenosas para mantener un nivel de eritropoyetina terapéuticamente efectivo en la circulación. Las composiciones farmacéuticas que contienen eritropoyetina humana natural o recombinante, se administran de manera habitual tres veces por semana en una dosis de aproximadamente 25-100 Unidades/kg. Esta forma de terapia con eritropoyetina, aunque resulta bastante efectiva, es muy cara e inconveniente ya que la administración intravenosa necesita con frecuencia una visita al doctor o al hospital. En la actualidad, una eritropoyetina humana recombinante hiperglicosilada análoga, la nueva proteína estimuladora de la eritropoyesis (NESP, por sus siglas en inglés) , se encuentra disponible bajo la marca comercial Aranesp® (Amgen Inc., Thousand Oaks, California) para el tratamiento de la anemia. Aranesp® puede ser administrada con menor frecuencia que la eritropoyetina habitual para obtener la misma respuesta biológica.

Una vía alternativa de administración es la inyección subcutánea. Esta forma de administración puede ser llevada a cabo por los pacientes en casa, y es más compatible con formulaciones de liberación retardada que ofrecen una absorción más lenta desde el sitio de administración, causando por tanto un efecto de liberación controlada. Sin embargo, se alcanzan niveles de circulación considerablemente lentos por la inyección subcutánea y, por tanto, se requieren frecuentes inyecciones para lograr el efecto terapéutico deseado. Más aún, la administración por vía subcutánea de fármacos proteicos resulta, en general, más inmunogénica que la administración por vía intravenosa, ya que la piel, como la mayor barrera a la infección, es un órgano inmune que es rico en células dendríticas y presenta mecanismos sensibles para identificar y responder a abrasiones y a materiales extraños. Casadevall et al. ha informado recientemente que pacientes a los que se está administrando eritropoyetina por vía subcutánea desarrollaron anticuerpos anti-eritropoyetina (Casadevall et al. (2002) N Engl. J. Med. 346 (7) :469-75) .

Por consiguiente, existe la necesidad de una terapia con eritropoyetina más eficiente que requiera administraciones menos frecuentes.

Resumen de la invención.

La presente invención proporciona proteínas de fusión de eritropoyetina con farmacocinética mejorada en comparación, en varias realizaciones, con la eritropoyetina natural o de tipo silvestre, con la eritropoyetina recombinante, o con el análogo de la eritropoyetina hiperglicosilada NESP (publicación del PCT WO 00/24893) . Por consiguiente, es un objeto de la presente invención simplificar la terapia con eritropoyetina y reducir los costes asociados con el tratamiento para humanos u otros mamíferos con trastornos o deficiencias hematopéyicos u otras indicaciones para la administración de eritropoyetina.

De manera específica, la presente invención proporciona una proteína de fusión biológicamente activa de Fceritropoyetina (Fc-EPO) que presenta una vida media en suero prolongada y una potencia in vivo aumentada.

“Proteína de fusión Fc-EPO”, tal y como se utiliza en la presente patente, hace referencia a una proteína que comprende un polipéptido con una porción Fc y una porción eritropoyetina. “Porción Fc”, tal y como se utiliza en la presente patente, abarca dominios obtenidos de la región constante de una inmunoglobulina, preferiblemente una inmunoglobulina humana, que incluye un fragmento, análogo, variante, mutante o derivado de la región constante. “Porción eritropoyetina”, tal como se utiliza en la presente patente, abarca eritropoyetina natural o de tipo silvestre de humanos u otras especies, eritropoyetina recombinante, y moléculas similares a la eritropoyetina, incluyendo fragmentos de eritropoyetina biológicamente activos, análogos, variantes, mutantes o derivados de la eritropoyetina.

La presente invención proporciona proteínas Fc-EPO sintetizadas en células BHK. Las proteínas de fusión de Fc-EPO de la invención sintetizadas en células BHK, han demostrado tener vidas medias en suero prolongadas y potencia in vivo aumentada en comparación con proteínas de fusión de Fc-EPO correspondientes producidas en otras líneas celulares, tales como, por ejemplo, células NS/0, PerC6, o 293. La presente invención además proporciona una población de proteínas de fusión Fc-EPO altamente sialiladas adecuadas para su administración a un mamífero. Las proteínas de fusión de Fc-EPO altamente sialiladas presentan vidas medias en suero de mayor duración y potencia in vivo aumentada en comparación, en varias realizaciones, con eritropoyetina natural o de tipo silvestre, con eritropoyetina recombinante, con el análogo de la eritropoyetina hiperglicosilada NESP, o con las proteínas de fusión Fc-EPO de la misma secuencia de aminoácidos sintetizada en células NS/0, PerC6 o 293. De acuerdo con la presente invención, una proteína de fusión Fc-EPO puede contener modificaciones de los aminoácidos en la porción Fc que, generalmente,... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión dimérica purificada que consiste, esencialmente, en una porción Fc dimérica de una molécula de IgG humana, que comprende una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, y eritropoyetina humana (EPO) , en donde cada cadena de la porción Fc dimérica está ligada por su C-terminal al N-terminal de una

molécula de EPO,

en donde dicha proteína de fusión Fc-EPO es producida en células BHK-21 en un medio libre de proteínas, y es seleccionada del grupo que consiste en:

(i) Fcg2h (FN ºAQ) -M1-EPO como se muestra mediante SEQ ID No. 14; y

(ii) Fcg2h (FN ºAQ) -M1-EPO (NDS) como se muestra mediante SEQ ID No. 15.

10 2. Una proteína de fusión Fc-EPO dimérica purificada de acuerdo a la reivindicación 1, en donde la proteína de fusión se produce en un medio DMEM/F-12.

3. Una proteína de fusión Fc-EPO dimérica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína de fusión se produce en un medio DMEM/F-12 que está complementado con aminoácidos, hidrolizados de proteínas, etanolamina, y tropolona.

15 4. Una composición farmacéutica que comprende en una cantidad efectiva una proteína de fusión Fc-EPO tal como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 – 3, de manera opcional junto con un soporte, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. Una proteína de fusión Fc-EPO dimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 – 3, o una

composición farmacéutica de la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de trastornos o deficiencias 20 hematopoyéticos en un mamífero.