Proteína de Capsicum chinense con actividad RNasa y DNasa.

La invensión se refiere a una proteína de Capsicum chinense la cual presenta actividad tanto DNasa como RNasa.

La presente invención también se refiere a la secuencia nucleotídica que codifica para dicha proteína así como a una construcción genética que contenga la secuencia nucleotídica, a un vector que contenga la construcción genética y a una célula hospedadora que contenga el vector. Esta invención también se refiere a los usos de la proteína.

Proteína de Capsicum chinense con actividad RNasa y DNasa.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología. Específicamente, se refiere a una proteína procedente de Capsicum chinense con actividad DNasa y RNasa, a su secuencia aminoacídica, a la secuencia nucleotídica que la codifica, a una construcción genética que contenga la secuencia nucleotídica, a un vector que contenga la construcción genética, a una célula hospedadora que contenga el vector, y a los usos de la proteína.

Estado de la técnica anterior

Los ácidos nucleicos se encuentran presentes en todas las células de los organismos vivos. Esta presencia en algunos procesos industriales o desarrollos de laboratorio no es deseable, ya que puede suponer la contaminación de las muestras. En múltiples ocasiones, por tanto, es necesaria la eliminación de los ácidos nucleicos, como por ejemplo en preparaciones bioquímicas o farmacéuticas. Para llevar a cabo esta eliminación, el proceso más extendido es la digestión mediante enzimas, bien DNasas o RNasas, en función de cual sea el ácido nucleico contaminante.

Las DNasas y RNasas están presentes en todos los organismos estudiados, desde bacterias a animales. Estas enzimas degradan DNA o RNA, y esta degradación puede darse de forma específica de secuencia, como en el caso de las enzimas de restricción, o de forma inespecífica, dando lugar a fragmentos de pequeño tamaño o incluso a mononucleótidos. En la literatura existen descritas distintas proteínas con actividad RNasa o DNasa que actúan sobre diversos sustratos, dando lugar a diferentes productos de reacción. Cada una de estas proteínas presenta unos requerimientos diferentes tanto de pH como de temperatura, presencia o ausencia de iones o cofactores, etc. para ser activas. Estas enzimas, en múltiples ocasiones, presentan especificidad de sustrato, y solo son capaces de degradar bien DNA de cadena doble, bien de cadena sencilla, o bien RNA.

En la actualidad, existen multitud de situaciones en las que resulta necesaria la digestión tanto de DNA como de RNA. Hoy por hoy existen descritas al menos 3 enzimas capaces de llevar a cabo esta digestión conjunta como son la Micrococcal nuclease (Alexander et al. 1961, Journal of Biological Chemistr y , 236 (11) : 3014-3019) la cual es una proteína derivada de Staphylococcus aureus que presenta una actividad nucleasa inespecífica, la endonucleasa de Serratia marcescens (Franke et al. 1998, FEBS lett, 425 (3) : 517-522) la cual es una endonucleasa inespecífica que degrada DNA y RNA de cadena simple o doble, y la nucleasa S1 de Aspergillus or y zae que presenta actividad preferentemente frente a DNA y RNA de cadena sencilla, aunque puede producir cortes en DNA y RNA de doble hebra (Esteban et al. 1992, Nucleic Acids Research, 20 (18) : 4932) .

Todas estas enzimas presentan como ventaja frente a las enzimas que únicamente portan actividad DNasa o RNasa, por ejemplo, que en procesos de purificación se reduce el número de manipulaciones. Debido a esto se reduce la posibilidad de contaminación del proceso y se acortan los protocolos de purificación. Por otro lado, la reducción del número de pasos del proceso implica una reducción de la cantidad de reactivos a utilizar abaratando los procesos de producción.

Cada una de estas enzimas presenta unas condiciones óptimas de actuación en cuanto a temperatura, pH, etc. Las condiciones de cada enzima serán óptimas para algunos procesos, mientras que no serán compatibles con otros procesos industriales. Por ello resulta necesario encontrar, bien una batería de enzimas que sean útiles en diversas condiciones, o bien nuevas enzimas útiles en multitud de condiciones para de esta forma poder optimizar los procesos industriales y aumentar su rentabilidad.

Para la investigación de estas enzimas se realizan búsquedas en diversos organismos, como pueden ser por ejemplo bacterias u hongos. Una alternativa podría ser la búsqueda de este tipo de enzimas en organismos más complejos, como por ejemplo las plantas.

En plantas se ha descrito la existencia tanto de ribonucleasas (RNasas) , como de deoxi-ribonucleasas (DNasas) las cuales se expresan bien de forma constitutiva o bien, por ejemplo, mediante la inducción en ciertas situaciones de estrés medioambiental o en la defensa vegetal frente a patógenos (Yen et al., 1991. Plant Physiol 97:1487-1493; Green, 1994. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 45:421-445; Sugiyama et al. 2000. Plant Mol. Bio. 44:387-397) .

En vegetales existen descritas diversas proteínas relacionadas con la patogénesis (PRs) . Algunas de estas proteínas tienen actividad RNasa y se inducen en la defensa de plantas frente a patógenos. Estas pueden ser por ejemplo las proteínas relacionadas con la patogénesis del grupo 10 de Capsicum annuum (Park et al., 2004. Plant J. 37, 186-198; US 7192775) , de Solanum surattense ode Astragalus mongholicus (Liu et al., 2006. J. Plant Physiol. 163, 546-556; Yan et al., 2008. Plant Physiol. Biochem. 46, 93-99) . La actividad RNasa ha sido también descrita para una proteína relacionada con la patogénesis del grupo 4 de trigo (Caporale et al., 2004. FEBS Letters 575, 71-76) . En dichas proteínas, sin embargo no se ha descrito que presenten actividad DNasa.

Existe por tanto la necesidad de encontrar enzimas que presenten actividad tanto DNasa como RNasa y que puedan servir de alternativa a las actuales, ya que de esta forma se podrá optimizar cada proceso utilizando la enzima más adecuada a las condiciones en que se realice.

Descripción de la invención

La presente invención refiere a un polipéptido aislado de Capsicum chinense con actividad DNasa y RNasa, así como a un polinucleótido que codifica para dicho polipéptido, a una construcción genética que contenga dicho polinucleótido, a un vector que pueda contener dicho polinucleótido o construcción genética, y a una célula hospedadora que pueda contener dicho polinucleótido, construcción genética o vector. La invención también se refiere a los usos del polipéptido.

En la presente invención se demuestra cómo una proteína obtenida de Capsicum chinense y de secuencia SEQ ID NO: 1 presenta actividad DNasa y RNasa. Esta presencia de ambas actividades en una única molécula convierte a esta proteína en un elemento de interés para la purificación de muestras tanto a nivel de laboratorio como a nivel industrial. Esta proteína presenta como ventajas su elevada termoestabilidad, la cual se deriva del hecho de que al ser autoclavada

o hervida no pierde su actividad RNasa. Por otro lado esta proteína también presenta como ventaja la no necesidad de la adición de cofactores para llevar a cabo su actividad.

De igual forma que ocurre con muchas de las proteínas descritas, como por ejemplo entre proteínas homologas en diferentes organismos, el polipéptido de Capsicum chinense podría tener alterado algún residuo aminoacídico sin que se produjera una alteración sustancial en la proteína. Esto significa que esta alteración no sería determinante en el polipéptido ni para su estructura ni para su actividad. Por todo ello un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido aislado (polipéptido de la invención) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 87%, preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95% y aun más preferiblemente un 98% de identidad sobre la longitud completa de la secuencia SEQ ID NO: 1. En una realización aún más preferida de este aspecto de la invención el polipéptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

Esta secuencia aminoacídica se ha demostrado en la presente invención que presenta actividad tanto DNasa como RNasa, por lo que una realización más preferida de este aspecto de la invención se refiere a un polipéptido aislado y purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 87%, preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95% y aun más preferiblemente un 98% de identidad sobre la longitud completa de la secuencia SEQ ID NO: 1 que presenta actividad DNasa y RNasa. Otra realización preferida se refiere al polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, que presenta actividad DNasa y RNasa.

El polipéptido de la invención puede presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia aminoacídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad del péptido. Esto quiere decir que la secuencia...

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 87% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1, sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 1.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1, sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 1 es de al menos el 90%.

3. Un polipéptido aislado según la reivindicación 2 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1, sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 1 es de al menos el 95%.

4. Un polipéptido aislado según la reivindicación 3 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1, sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 1 es de al menos el 98%.

5. Un polipéptido aislado según la reivindicación 4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:

1.

6. Un polipéptido aislado y según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el polipéptido presenta actividad DNasa y RNasa.

7. Un polinucleótido aislado que codifica para el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones1a6, ouna secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado.

8. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 7 que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 75% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2, o una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado.

9. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 8 que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 85% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2, o una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado.

10. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 9 que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 90% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2, o una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado.

11. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 10 que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 95% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2, o una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado.

12. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 11 que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 98% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2, o una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado.

13. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 12 que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2, o una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado.

14. Una construcción genética que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones7a13.

15. Un vector que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 o la construcción genética según la reivindicación 14.

16. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, la construcción génica según la reivindicación 14, o el vector según la reivindicación 15.

17. Una célula hospedadora según la reivindicación 16 donde la célula es una célula vegetal.

18. Semilla que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, la construcción génica según la reivindicación 14, o el vector según la reivindicación 15.

19. Cultivo de células vegetales según la reivindicación 17.

20. Planta que comprende células según la reivindicación 17.

21. Planta según la reivindicación anterior que es obtenida tras el crecimiento de una célula según la reivindicación 17, de un grupo de células según la reivindicación 19, o de la semilla según la reivindicación 18.

22. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones1a6 para la purificación de elementos de origen biológico.

23. Uso de un polipéptido según la reivindicación 22, donde el elemento de origen biológico es una proteína.

24. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones1a6 para la elaboración de un medicamento.

25. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas.

26. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas, donde el agente infeccioso es un hongo.

27. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas, donde el agente infeccioso es un virus.

28. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas, donde el agente infeccioso es una bacteria.

29. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 donde el organismo infectado es una planta.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas

<120> Proteína de Capsicum chinense con actividad RNasa y DNasa.

<130> ES1641.636

<160> 2

<170> PatenIn version 3.5

<210> 1

<211> 143

<212> PRT

<213> Capsicum chinense

<400> 1

<210> 2

<211> 692

<212> DNA

<213> Capsicum chinense

ES 2 365 234 A1

<400> 2