Promotor.

Promotor, caracterizado porque dicho promotor consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID

NO: 04.

Promotor La presente invención se refiere al sector de la expresión de proteínas y la selección de células. Se da a conocer un promotor con baja potencia promotora y, por lo tanto, con una expresión limitada de un ácido nucleico que codifica, enlazado operativamente.

Antecedentes de la Invención La expresión de proteínas es un proceso fundamental en las células vivas. Toda la información requerida para la expresión de proteínas es facilitada por un único ácido nucleico. Este ácido nucleico no sólo contiene la información de la secuencia de aminoácidos de la proteína, sino que también proporciona la información de regulación requerida (por ejemplo, el sitio de unión ribosómico, las señales de inicio y final para la transcripción, señales de corte y empalme, elementos amplificadores, etc.) , incluyendo un promotor / secuencia de promotor.

Un promotor es un ácido nucleico que regula la magnitud de la transcripción de un ácido nucleico, por ejemplo, codificando un polipéptido, al que está enlazado operativamente, en un pre-mARN. Es un elemento de control de la transcripción, que está situado alrededor del sitio de inicio de ARN polimerasa en el extremo 5' de una secuencia que codifica enlazada operativamente. Del análisis del promotor temprano SV40 se conoce que lugares de conocimiento / unión para activadores de transcripción están contenidos en promotores en segmentos que consisten en 7-20 pares de bases. Un segmento es el sitio de inicio para la síntesis de ARN, por ejemplo, la bien conocida secuencia TATA. Otros segmentos, situados aproximadamente a 30-110 pares de bases de 5', es decir, más arriba con respecto al sitio de inicio para la síntesis de ARN, definen la frecuencia de inicio de transcripción. Un promotor requiere, como mínimo, un segmento que inicia la síntesis de ARN en un sitio específico y en una dirección definida, es decir, en dirección 5 'a 3'.

Los promotores más conocidos son lac-lpp, ara-, lac-, tac-, trc-, trp-, phoA-, PBAD-, λPL-, lpp y el promotor T7. El promotor SV40 es una secuencia de ácido nucleico derivada del genoma de Simio (vacuolante) Virus 40. Para la producción recombinante de un polipéptido heterólogo en una célula eucariota o procariota se introducen normalmente uno o más plásmidos de expresión en la célula. El plásmido o plásmidos de expresión comprende un casete de expresión para la expresión de un polipéptido heterólogo y asimismo un casete de expresión para la expresión de un marcador seleccionable, que es necesario para la selección de células transfectadas que expresan el polipéptido heterólogo. La síntesis del polipéptido heterólogo y del marcador seleccionable requiere una fracción de la maquinaria de expresión de la célula.

Dado que el objetivo es producir predominantemente el polipéptido heterólogo, la mayor parte de la capacidad disponible de la maquinaria de expresión de la célula debe ser asignada a la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo. Sólo una cantidad reducida debe ser utilizada para la expresión del marcador seleccionable. Esta asignación de capacidad de expresión es llevada a cabo con intermedio de la potencia de los promotores correspondientes. Cuanto más potente es un promotor, mayor es la cantidad del ácido nucleico enlazado operativamente que se transcribe y, por lo tanto, se traduce. Por lo tanto, existe la necesidad de promotores con potencia de promotor ajustable o reducible.

Taylor, W.E., y otros (Endocrinol. 137 (1996) 5407-5414) han dado a conocer variantes de deleción de promotor de factor de célula madre humana. En la solicitud de patente US 2007/0092968 se dan a conocer un nuevo promotor hTMC y vectores para la expresión selectiva de tumores y de alta eficacia de expresión de genes terapéuticos del cáncer. Fromm y otros (J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982) 457-481 y ibid 2 (1983) 127-135) han dado a conocer mapeado de deleción y mutantes de deleción de promotor SV-40 de la región inicial. Se han dado a conocer fragmentos de quitinasa de unión a quitina en el documento US 6.399.571. El documento WO 99/62927 da a conocer factor 4 de crecimiento de tejidos conectivos.

Resumen de la Invención El primer aspecto de la presente invención es un promotor que tiene, es decir, consiste en una secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 04.

Otro aspecto de la presente invención es un método para la selección de una célula que comprende las etapas siguientes en este orden:

a) transfectar una célula eucariota con un ácido nucleico que comprende i) un primer casete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo, ii) un segundo casete de expresión que comprende el promotor que consiste en SEQ ID NO: 04 y un segundo ácido nucleico que codifica el marcador seleccionable, de manera que el primer ácido nucleico está enlazado operativamente al segundo ácido nucleico, b) cultivar dicha célula transfectada en condiciones adecuadas de crecimiento de la célula eucariota no transfectada, c) seleccionar una célula que se propaga en la etapa b) y asimismo i) propagar en condiciones selectivas de cultivo, o ii) expresar el marcador seleccionable.

En una realización de este aspecto de la invención, la célula eucariota es una célula de mamífero. En una realización preferente, la célula de mamífero es una célula CHO, célula BHK o célula PER.C6®, o célula HEK, o célula Sp2/0. En otra realización, el polipéptido heterólogo es una inmunoglobulina, o un fragmento de inmunoglobulina, o un conjugado de inmunoglobulina. En una realización, el marcador seleccionable es una neomicin-aminoglucósido fosfotransferasa, o una higromicin-fosfotransferasa, o dLNGFR, o GFP.

Un aspecto de la presente invención es un método para la expresión de un polipéptido heterólogo que comprende las siguientes etapas siguiendo este orden:

a) transfectar una célula de mamífero con un ácido nucleico comprendiendo un casete de expresión que comprende promotor que consiste en SEQ ID NO: 04 enlazado operativamente a un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo, b) seleccionar una célula transfectada en la etapa a) , c) cultivar la célula seleccionada en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido heterólogo, d) recuperar el polipéptido heterólogo de la célula o del medio de cultivo.

En una realización de este aspecto de la presente invención, la célula de mamífero es una célula CHO, una célula BHK, o una célula PER.C6®, o célula HEK, o célula Sp2/0. En otra realización, el segundo ácido nucleico codifica una inmunoglobulina, o un fragmento de una inmunoglobulina, o un conjugado de inmunoglobulina. En otra realización adicional, el ácido nucleico comprende un casete de expresión que codifica un marcador seleccionable.

Descripción detallada de la invención La presente invención da a conocer un nuevo ácido nucleico promotor con una secuencia de nucleótido SEC ID NO:

04.

Se conocen, por los técnicos en la materia, métodos y técnicas útiles para llevar a cabo la presente invención y se describen, por ejemplo, en Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes I a III (1997) , y Sambrook, y otros., Molecular Cloning: A Laborator y Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) . Tal como es conocido por los técnicos en la materia, posibilita la utilización de tecnología de ADN recombinante la producción de numerosos derivados de un ácido nucleico y/o polipéptido. Dichos derivados pueden ser modificados, por ejemplo, en una o varias posiciones por sustitución, alteración, intercambio, deleción o inserción. La modificación o derivatización pueden ser llevadas a cabo, por ejemplo, por medio de mutagénesis dirigida al sitio. Estas modificaciones pueden ser fácilmente llevadas a cabo por un técnico en la materia (ver, por ejemplo Sambrook, J., y otros, Molecular Cloning: A laborator y manual (1999) Cold Spring Harbor Laborator y Press, New York, USA) . La utilización de tecnología recombinante posibilita a un técnico en la materia para transformar varias células huésped con ácido o ácidos nucleicos heterólogos.

Un "promotor" se refiere a un ácido nucleico, es decir, una secuencia de polinucleótidos, que controla la transcripción de un ácido nucleico al que está enlazado operativamente. Un promotor puede incluir señales para unión de ARN polimerasa e iniciación de transcripción. El promotor o promotores utilizados podrán funcionar... [Seguir leyendo]

1. Promotor, caracterizado porque dicho promotor consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID

NO: 04. 5

2. Método para la selección de una célula que expresa un polipéptido heterólogo, caracterizado por comprende las siguientes etapas:

a) transfectar una célula de mamífero con un ácido nucleico comprendiendo i) un primer casete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo, ii) un segundo casete de expresión que comprende el promotor, según la reivindicación 1, y un segundo ácido nucleico que codifica una aminoglicósido fosfotransferasa seleccionada entre higromicina fosfotransferasa, neomicina y G418 aminoglicósido fosfotransferasa, de manera que dicho promotor, según la reivindicación 1, y segundo ácido nucleico están enlazados operativamente, b) cultivar dicha célula transfectada en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicha célula no transfectada, c) seleccionar una célula que se propaga en la etapa b) en condiciones de cultivo selectivas por citometría de flujo.

3. Método para la selección de una célula que expresa un polipéptido heterólogo, caracterizado por comprende las siguientes etapas:

a) transfectar una célula de mamífero con un ácido nucleico comprendiendo i) un primer casete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo, ii) un segundo casete de expresión que comprende el promotor, según la reivindicación 1, y un segundo ácido nucleico que codifica dLINGFR ó GFP, de manera que dicho promotor, según la reivindicación 1, y segundo ácido nucleico están enlazados operativamente, b) cultivar dicha célula transfectada en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicha célula no transfectada, c) seleccionar una célula que se propaga en la etapa b) en condiciones de cultivo selectivas por citometría de flujo.

4. Método para la expresión de un polipéptido heterólogo, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

45 a) transfectar una célula de mamífero con un ácido nucleico que comprende un casete de expresión que comprende un promotor, según la reivindicación 1, enlazado operativamente a un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo, b) seleccionar una célula transfectada en la etapa a) por citometría de flujo, c) cultivar la célula seleccionada de la etapa b) en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido heterólogo, 55 d) recuperar el polipéptido heterólogo de la célula o el medio de cultivo.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un segundo casete de expresión que codifica una aminoglicósido fosfotransferasa seleccionada entre higromicina fosfotransferasa, neomicina y G418 aminoglicósido fosfotransferasa.

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque dicho polipéptido heterólogo es una inmunoglobulina o un fragmento de una inmunoglobulina o un conjugado de inmunoglobulina.

7. Método para la expresión de un polipéptido heterólogo, caracterizado porque comprende las siguientes 65 etapas:

a) transfectar una célula CHO con un ácido nucleico que comprende un promotor, según la reivindicación 1, enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y un ácido nucleico que comprende un promotor adicional seleccionado de SV40 ó CMV enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo, b) seleccionar una célula CHO transfectada en la etapa a) por citometría de flujo, c) cultivar la célula CHO seleccionada de la etapa b) en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido heterólogo, d) recuperar el polipéptido heterólogo de la célula o el medio de cultivo.

8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque la citometría de flujo es clasificación de células activada por fluorescencia. 15