Proceso para separar y determinar la carga viral en una muestra de pancreatina.

Un proceso para separar una carga viral de una muestra de pancreatina,

comprendiendo el proceso lasetapas:

a) producir una muestra de ensayo de pancreatina líquida adecuada para centrifugado a partir de la muestra de pancreatina sin, al hacerlo, cambiar la carga viral de la muestra,

b) someter al menos una parte definida de la muestra de ensayo de pancreatina de la etapa a) del proceso a almenos un centrifugado a baja velocidad en condiciones, en las cuales los virus con constantes de sedimentaciónde ≥ 120 S aún no forman un sedimento,

c) desechar cualquier depósito sólido que surja en la etapa b) del proceso durante el centrifugado a bajavelocidad y conservar un sobrenadante de la muestra de ensayo de pancreatina,

d) someter al menos una parte definida del sobrenadante de la muestra de ensayo de pancreatina obtenido en laetapa c) del proceso a ultracentrifugado en un medio con gradiente discontinuo durante un periodo de al menos 1hora, en el que la fuerza centrífuga relativa es al menos 100.000 x g, y

e) separar de forma cuantitativa la fracción diana que contiene la carga viral del sobrenadante de la muestra deensayo de pancreatina.

Proceso para separar y determinar la carga viral en una muestra de pancreatina.

La presente invención se refiere a un proceso para separar sustancialmente de forma cuantitativa la carga viral de una muestra de pancreatina y a un proceso para determinar de forma cuantitativa la carga viral de esta muestra de pancreatina.

La pancreatina es una mezcla conocida desde hace mucho de diversos constituyentes fisiológicamente activos obtenidos de glándulas pancreáticas de mamífero. Los principales constituyentes de la pancreatina son enzimas digestivas, en particular lipasa pancreática, pero también amilasas y proteasas. Gracias a sus valiosas propiedades terapéuticas y alto nivel de seguridad durante el uso, la pancreatina se ha usado durante mucho tiempo de forma muy exitosa como preparación farmacéutica en terapia de sustitución enzimática. La lipasa pancreática es la de mayor importancia en este caso, pero las amilasas y proteasas también realizan una contribución considerable a los beneficios terapéuticos de la pancreatina. La pancreatina con fines terapéuticos se obtiene habitualmente del ganado vacuno (“pancreatina bovina”) o de cerdos (“pancreatina porcina”) , con la pancreatina porcina siendo de la mayor importancia en términos de cantidad. Los métodos para la producción de pancreatina con fines terapéuticos se conocen per se, por ejemplo de la publicación EP 0 115 023 A.

Debido a la naturaleza de la pancreatina obtenida de animales, los materiales de partida pueden estar acompañados típicamente por componentes biológicos no deseados, tales como contaminantes bacterianos o virales. Sin embargo, durante más de 100 años de comercialización de productos farmacéuticos que contienen pancreatina, no se ha descrito ningún caso en el que los pacientes hayan sido afectados por pancreatina contaminada por virus. Sin embargo, las compañías que producen productos farmacéuticos derivados de tejidos biológicos y/o fluidos corporales experimentan una presión cada vez mayor por parte de los organismos reguladores para que aumenten el nivel de seguridad de sus productos reduciendo todos los contaminantes al nivel más bajo posible, independientemente de si cualquier contaminante en cuestión está considerado o no como un patógeno humano. Para la aplicación de pancreatina en productos farmacológicos, es deseable, por lo tanto, contar con métodos analíticos fiables para detectar y cuantificar dichos contaminantes biológicos.

Hasta la fecha, no se ha desarrollado ningún método fiable para detectar o separar de forma cuantitativa contaminantes virales en una muestra de pancreatina. Esto se debe, probablemente, al hecho de que los constituyentes enzimáticamente activos de la pancreatina son incompatibles con las líneas celulares usadas típicamente para multiplicar virus usando técnicas conocidas por un experto en la materia, haciendo de este modo más difícil o incluso imposible determinar el valor cuantitativo viral en una muestra de pancreatina.

Por consiguiente, era el objeto de la invención proporcionar un proceso para separar de forma sustancialmente cuantitativa la carga viral de una muestra de pancreatina y un proceso para determinar de forma cuantitativa la carga viral de esta muestra de pancreatina. En particular, era un objeto de la invención proporcionar un proceso para separar de forma sustancialmente cuantitativa una carga viral infecciosa de una muestra de pancreatina y un proceso para determinar de forma cuantitativa la carga viral infecciosa de esta muestra de pancreatina.

Ahora se ha descubierto, sorprendentemente, que la carga viral, en particular la carga viral infecciosa, de una muestra de pancreatina puede determinarse se forma sustancialmente cuantitativa si la carga viral se separa en primer lugar de la muestra de pancreatina en un proceso de centrifugado de múltiples fases y la carga viral separada se determina a continuación de forma cuantitativa usando métodos virológicos conocidos per se.

La publicación JP 12856990 ya ha descrito un método para concentrar o aislar virus de la hepatitis mediante una combinación no específica de centrifugado a baja velocidad y ultracentrifugado.

En una primera realización, la invención se refiere a un proceso para separar la carga viral de una muestra de pancreatina, comprendiendo el proceso las etapas:

a) producir una muestra de ensayo de pancreatina líquida adecuada para centrifugado desde la muestra de pancreatina sin, al hacerlo, cambiar la carga viral de la muestra,

b) someter a al menos una parte definida de la muestra de ensayo de pancreatina de la etapa a) del proceso a al menos un centrifugado a baja velocidad en condiciones, en las que virus con constantes de sedimentación de 120 S aún no forman un sedimento,

c) desechar cualquier depósito sólido que surja opcionalmente en la etapa b) del proceso durante el centrifugado a baja velocidad y conservar un sobrenadante de la muestra de ensayo de pancreatina,

d) someter a al menos una parte definida del sobrenadante de la muestra de ensayo de pancreatina obtenido en la etapa c) del proceso a ultracentrifugado en un medio con gradiente discontinuo, en el que la duración del ultracentrifugado y la fuerza centrífuga relativa para el ultracentrifugado se seleccionan de modo que la carga viral es transportada de forma cuantitativa fuera del sobrenadante de la muestra de ensayo de pancreatina a una fracción diana situada por encima o en la capa límite entre el componente del menor gradiente de concentración, suprayacente y el componente con mayor gradiente de concentración siguiente, subyacente, y

e) separar de forma cuantitativa la fracción diana que contiene la carga viral del sobrenadante, de la muestra de ensayo de pancreatina.

En una segunda realización, la invención se refiere a un proceso para determinar de forma cuantitativa la carga viral de la muestra de pancreatina, en particular la carga viral infecciosa de la muestra de pancreatina. En esta segunda realización, además del proceso de acuerdo con la primera realización, en una etapa f) del proceso adicional después de la etapa e) del proceso, se realiza una determinación cuantitativa de la carga viral de la muestra de pancreatina determinando el valor cuantitativo de infección viral en la fracción diana que contiene la carga viral.

A menos que se especifique otra cosa en este documento, cualesquiera términos técnicos y científicos indicados a continuación tendrán, en cada caso, el mismo significado que el que un experto en la materia entiende convencionalmente que tienen. Los intervalos de temperatura mencionados en lo sucesivo en este documento en el formato de, por ejemplo, “0-15ºC” designan un intervalo de temperatura de 0ºC a 15ºC con los límites del intervalo estando incluidos en cada caso. Los intervalos de tiempo mencionados en lo sucesivo en este documento en el formato de, por ejemplo, “30-120 minutos” designan un intervalo de tiempo de 30 minutos a 120 minutos con los límites del intervalo estando incluidos en cada caso. Los intervalos de tiempo mencionados en lo sucesivo en este documento en el formato de, por ejemplo, “2-8 horas” designan un intervalo de tiempo de 2 horas a 8 horas con los límites del intervalo estando incluidos en cada caso. Los intervalos de la fuerza centrífuga relativa mencionados en lo sucesivo en este documento en el formato de, por ejemplo, “1.500-5.000 x g” designan una fuerza centrífuga relativa en el intervalo de 1.500 x g a 5.000 x g con los límites del intervalo estando incluidos en cada caso. Los intervalos de volumen mencionados en lo sucesivo en este documento en el formato de, por ejemplo, “10-15 ml” designan un intervalo de volumen de 10 mililitros a 15 mililitros con los límites del intervalo estando incluidos en cada caso. La medición de los intervalos de longitud mencionados en lo sucesivo en este documento en el formato de, por ejemplo, “80-100 mm” designa una medición del intervalo de longitud de 80 milímetros a 100 milímetros con los límites del intervalo estando incluidos en cada caso.

El proceso de acuerdo con la invención es adecuado para todos los tipos de pancreatina de origen animal y puede realizarse en particular en pancreatinas porcinas comerciales convencionales y en pancreatinas bovinas. El proceso se realiza preferentemente en muestras de pancreatina porcina.

El proceso de acuerdo con la invención es generalmente adecuado para separar la carga... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para separar una carga viral de una muestra de pancreatina, comprendiendo el proceso las etapas:

a) producir una muestra de ensayo de pancreatina líquida adecuada para centrifugado a partir de la muestra de pancreatina sin, al hacerlo, cambiar la carga viral de la muestra,

b) someter al menos una parte definida de la muestra de ensayo de pancreatina de la etapa a) del proceso a al menos un centrifugado a baja velocidad en condiciones, en las cuales los virus con constantes de sedimentación de 120 S aún no forman un sedimento,

c) desechar cualquier depósito sólido que surja en la etapa b) del proceso durante el centrifugado a baja velocidad y conservar un sobrenadante de la muestra de ensayo de pancreatina,

d) someter al menos una parte definida del sobrenadante de la muestra de ensayo de pancreatina obtenido en la etapa c) del proceso a ultracentrifugado en un medio con gradiente discontinuo durante un periodo de al menos 1 hora, en el que la fuerza centrífuga relativa es al menos 100.000 x g, y

e) separar de forma cuantitativa la fracción diana que contiene la carga viral del sobrenadante de la muestra de ensayo de pancreatina.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que adicionalmente en una etapa f) del proceso después de la etapa e) del proceso se realiza una determinación cuantitativa de la carga viral de la muestra de pancreatina determinando el valor cuantitativo de infección viral en la fracción diana que contiene la carga viral.

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la fracción diana diluida o sin diluir se filtra a través de un microfiltro antes de que se realice la determinación cuantitativa de la carga viral.

4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en la etapa a) del proceso la muestra de ensayo de pancreatina se produce como una suspensión de muestra de ensayo de pancreatina combinando la muestra de pancreatina con un medio de cultivo celular que es adecuado para la línea celular usada para cultivar el tipo de virus a investigar y con uno o más antibióticos.

5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la producción de la suspensión de la muestra de ensayo de pancreatina continúa con refrigeración a una temperatura de 0-15ºC.

6. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los centrifugados a baja velocidad en la etapa b) del proceso se realizan, en cada caso, con una fuerza centrífuga relativa de menos de 10.000 × g.

7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los centrifugados a baja velocidad en la etapa b) del proceso se realizan, en cada caso, con una fuerza centrífuga relativa de 1.500-5.000 × g.

8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los centrifugados a baja velocidad en la etapa b) del proceso se realizan durante un periodo de al menos 5 minutos.

9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el ultracentrifugado en la etapa d) del proceso se realiza durante un periodo de 2-8 horas y la fuerza centrífuga relativa es de 200.000-350.000 × g.

10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los centrifugados a baja velocidad en la etapa b) del proceso y el ultracentrifugado en la etapa d) del proceso se realizan, en cada caso, con refrigeración a una temperatura de 0-15ºC.

11. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio de gradiente discontinuo introducido en la etapa d) del proceso es un gradiente de sacarosa de dos fases discontinuo.

12. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el medio de gradiente discontinuo es un gradiente preparado a partir de una solución de sacarosa tamponada al 50% (peso/volumen) y una solución de sacarosa tamponada al 20% (peso/volumen) .

13. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra de pancreatina es una muestra de pancreatina porcina.

14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la carga viral de la muestra de ensayo de pancreatina comprende rotavirus A bovino, virus de encefalomiocarditis, circovirus porcino, parvovirus porcino, rotavirus A porcino, teschovirus porcino y/o virus de enfermedad vesicular porcina.