Procedimientos para producir moléculas de ARN de interferencia en células de mamífero y usos terapéuticos para tales moléculas.
Uno o más vectores para su uso en terapia que comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia bicatenario,
pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que el primer casete y el segundo casete están en el mismo vector o están en vectores separados y en los que cuando el uno o más vectores se introducen en una célula de mamífero la molécula de ARNip puede expresarse e iniciar la interferencia de ARN de la expresión de un gen diana en la célula de mamífero, inhibiendo de ese modo la expresión del gen diana.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/004203.
Solicitante: CITY OF HOPE.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1500 EAST DUARTE ROAD DUARTE CALIFORNIA 91010 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: ROSSI,JOHN,J, LEE,NAN-SOOK.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K48/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
- C07H21/02 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con ribosilo como radical sacárido.
- C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C12N15/85 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células animales.
- C12N15/86 C12N 15/00 […] › Vectores virales.
- C12P19/34 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
PDF original: ES-2312753_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para producir moléculas de ARN de interferencia en células de mamífero y usos terapéuticos para tales moléculas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la interferencia de ARN. Más particularmente, la presente invención se refiere a procedimientos para producir moléculas de ARN de interferencia en células de mamífero, con la excepción de células madre embrionarias humanas o células germinales humanas, y a los usos terapéuticos para tales moléculas expre- sadas.
Antecedentes de la invención
La interferencia de ARN es el proceso de silenciamiento génico postranscripcional, específico de secuencia, en animales y plantas iniciado por ARN bicatenario (bc) que es homólogo al gen silenciado (Hammond, S.M. et al., 2000; Fire, A., 1999; Sharp, P.A., 2001). En particular, se sabe que ARNip sintéticos y endógenos dirigen la degradación de ARNm seleccionado como diana (Hammond, S.M. et al., 2000; Elbashir, S.M. et al., 2001; Caplen, N.J. et al., 2001; Clemens, J.C. et al., 2000; Lipardi, C. et al., 2001; Elbashir, S.M. et al., 2001; Ui-Tei, K. et al., 2000).
Esta potente tecnología genética ha implicado habitualmente la inyección o transfección de ARN bc en organismos modelo. La interferencia de ARN también es un potente inhibidor de la expresión del gen seleccionado como diana en una variedad de organismos (Wianny, F. et al., 2000; Kennerdell, J.R. et al., 1998; Fire, A. et al., 1998; Oelgeschlager, M. et al., 2000; Svoboda, P. et al., 2000). Recientes estudios por varios grupos (Lipardi, C. et al., 2001; Sijen, T. et al., 2001) sugieren que todos los ARN de interferencia pequeños bc (ARNip) son parte de un complejo de riboproteína que incluye una nucleasa relacionada con la ARNasa III (Dicer) (Bernstein, E. et al., 2001), una familia de helicasas (Dalmay, T. et al., 2001; Cogoni, C. et al., 1999) y posiblemente una quinasa (Nykanen, A. et al., 2001) y una RdRP (Lipardi, C. et al., 2001; Smardon, A. et al., 2000). El mecanismo propuesto por Ligardi et al. (Lipardi, C. et al., 2001) es que uno de los oligómeros de ARNip (antisentido con respecto al ARN diana) ceba una RdRP, generando ARNbc más largos, que entonces se escinden mediante la actividad ARNasa III en dúplex de ARNip adicionales, modificando de ese modo los ARNip del molde diana.
El ARNbc
La presente invención supera al menos la limitación anterior.
Sumario de la invención
La presente invención implica procedimientos para producir moléculas de ARN de interferencia, bicatenario en células de mamífero, y preferiblemente células humanas, introduciendo en las células secuencias de ADN que codifican las moléculas de ARN de interferencia.
El procedimiento comprende a) insertar secuencias de ADN que codifican una cadena sentido y una cadena antisentido de una molécula de ARN de interferencia en un vector que comprende un promotor de ARN pol III y b) introducir el vector en una célula de mamífero de modo que puede expresarse la molécula de ARN.
En una realización preferida, la presente invención incluye seleccionar en primer lugar una secuencia diana, que preferiblemente es accesible para el apareamiento entre la secuencia diana y el ARN de interferencia requerido para que el ARN de interferencia funcione de manera apropiada. Pueden llevarse a cabo procedimientos para identificar sitios diana usando oligonucleótidos de ADN sintéticos en extractos celulares y/o un enfoque de selección de sitio sobre ARN nativo, tal como se describe en el presente documento. Una vez identificado un sitio diana óptimo, pueden sintetizarse las secuencias apropiadas para preparar las cadenas sentido y antisentido de la molécula de ARN de interferencia.
Los sitios diana posibles incluyen los encontrados en productos de transcripción de genes de agentes infecciosos o celulares (virales, bacterianos, etc.).
En una realización preferida, la molécula de ARN producida es una molécula de ARN de interferencia pequeño (ARNip), mientras que las secuencias de ADN que codifican las cadenas sentido y antisentido del ARNip son ADNip.
En una realización preferida, el promotor de ARN pol III es un promotor de U6 de mamífero, y más preferiblemente el promotor de ARN pol III U6 humano.
Según un aspecto, la presente invención proporciona uno o más vectores que comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor de ARN pol III, operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia bicatenario, pequeño (ARNip) para su uso en terapia y (ii) un segundo casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que el primer casete y el segundo casete están en el mismo vector o están en vectores separados y en los que cuando el uno o más vectores se introducen en una célula de mamífero la molécula de ARNip puede expresarse e iniciar la interferencia de ARN de la expresión de un gen diana en la célula de mamífero, inhibiendo de ese modo la expresión del gen diana.
Según otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de uno o más vectores para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del VIH, en el que el uno o más vectores comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia bicatenario, pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que el primer casete y el segundo casete están en el mismo vector o están en vectores separados y en los que cuando el uno o más vectores se introducen en una célula de mamífero la molécula de ARNip puede expresarse e iniciar la interferencia de ARN de la expresión de un gen diana de VIH en la célula de mamífero, inhibiendo de ese modo la expresión del gen diana de VIH.
Según un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento in vitro para someter a prueba la expresión y función de moléculas de ARNip, que comprende: cointroducir en una célula de mamífero in vitro (a) uno o más vectores que comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia bicatenario, pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que el primer casete y el segundo casete están en el mismo vector o están en vectores separados y (b) un vector que comprende un promotor que comprende un promotor operativamente unido a un gen diana, hacer crecer la célula en condiciones en las que se expresa la molécula de ARNip y someterla a prueba para determinar la iniciación de la interferencia de ARN de la expresión del gen diana, mediante lo cual se somete a prueba la función de la molécula de ARNip. Según este aspecto de la invención, la función y expresión endógena de la molécula de ARNip puede someterse a ensayo basándose en la presencia, si es el caso, de interferencia de ARN y más particularmente... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Uno o más vectores para su uso en terapia que comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia bicatenario, pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que el primer casete y el segundo casete están en el mismo vector o están en vectores separados y en los que cuando el uno o más vectores se introducen en una célula de mamífero la molécula de ARNip puede expresarse e iniciar la interferencia de ARN de la expresión de un gen diana en la célula de mamífero, inhibiendo de ese modo la expresión del gen diana.
2. El uno o más vectores según la reivindicación 1, en los que la célula de mamífero es una célula humana.
3. El uno o más vectores según la reivindicación 1, en los que el primer y segundo casetes están en vectores separados.
4. El uno o más vectores según la reivindicación 1, en los que el primer y el segundo casetes están en el mismo vector.
5. El uno o más vectores según la reivindicación 1, en los que el vector es un vector de plásmido.
6. El uno o más vectores según la reivindicación 1, en los que el vector es un vector viral.
7. El uno o más vectores según la reivindicación 1, en los que el promotor de ARN pol III es un promotor de ARN pol III U6 de mamífero.
8. El uno o más vectores según la reivindicación 1, en los que el gen diana es un gen diana de VIH.
9. El uno o más vectores según la reivindicación 8, en los que el VIH es VIH-1.
10. El uno o más vectores según la reivindicación 9, en los que el gen diana de VIH es VIH-1 rev.
11. El uno o más vectores según la reivindicación 9, en los que el gen diana de VIH es VIH-1 tat.
12. El uno o más vectores según la reivindicación 9, en los que el gen diana de VIH es ambos VIH-1 rev y VIH-1 tat.
13. El uno o más vectores según la reivindicación 9, en los que la célula de mamífero es una célula humana infectada por VIH.
14. Uso de uno o más vectores para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del VIH, en el que el uno o más vectores comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia bicatenario, pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que el primer casete y el segundo casete están en el mismo vector o están en vectores separados y en los que cuando el uno o más vectores se introducen en una célula de mamífero la molécula de ARNip puede expresarse e iniciar la interferencia de ARN de la expresión de un gen diana de VIH en la célula de mamífero, inhibiendo de ese modo la expresión del gen diana de VIH.
15. El uso según la reivindicación 14, en el que la célula de mamífero es una célula humana.
16. El uso según la reivindicación 14, en el que el primer y el segundo casetes están en vectores separados.
17. El uso según la reivindicación 14, en el que el primer y el segundo casetes están en el mismo vector.
18. El uso según la reivindicación 14, en el que el vector es un vector de plásmido.
19. El uso según la reivindicación 14, en el que el vector es un vector viral.
20. El uso según la reivindicación 14, en el que el promotor de ARN pol III es un promotor de ARN pol III U6 de mamífero.
21. El uso según la reivindicación 14, en el que el VIH es VIH-1.
22. El uso según la reivindicación 21, en el que el gen diana de VIH es VIH-1 rev.
23. El uso según la reivindicación 21, en el que el gen diana de VIH es VIH-1 tat.
24. El uso según la reivindicación 21, en el que el gen diana de VIH es ambos VIH-1 rev y VIH-1 tat.
25. El uso según la reivindicación 14, en el que la célula de mamífero es una célula humana infectada por VIH.
26. Un procedimiento in vitro para someter a prueba la expresión y función de moléculas de ARN de interferencia pequeño (ARNip), que comprende cointroducir en una célula de mamífero in vitro (a) uno o más vectores que comprenden (i) un primer casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena sentido de una molécula de ARN de interferencia bicatenario pequeño (ARNip) y (ii) un segundo casete que comprende un promotor de ARN pol III operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica la cadena antisentido de la molécula de ARNip, en los que el primer casete y el segundo casete están en el mismo vector o están en vectores separados y (b) un vector que comprende un promotor operativamente unido a un gen diana, hacer crecer la célula en condiciones en las que se expresa la molécula de ARNip y someterla a prueba para determinar la iniciación de la interferencia de ARN de la expresión del gen diana, mediante lo cual se somete a prueba la función de la molécula de ARNip.
27. El procedimiento según la reivindicación 26, en el que la célula de mamífero es una célula humana.
28. El procedimiento según la reivindicación 26, en el que el primer y el segundo casetes están en vectores separados.
29. El procedimiento según la reivindicación 26, en el que el primer y el segundo casetes están en el mismo vector.
30. El procedimiento según la reivindicación 26, en el que el promotor de ARN pol III es un promotor de ARN pol III U6 de mamífero.
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