Procedimiento para predecir la supervivencia de un paciente que padece CPNM a un tratamiento de quimioterapia a base de cisplatino o carboplatino y proporcionar una respuesta completa o parcial a la quimioterapia a base de cisplatino o carboplatino,

comprendiendo dicho procedimiento la etapa de determinar el estado de metilación de un ácido nucleico que codifica 14-3-3 sigma en una muestra biológica del paciente, en el que la presencia de metilación es indicativa de una mayor supervivencia de dicho paciente como una respuesta a dicho tratamiento de quimioterapia.

Procedimiento para predecir la respuesta clínica al tratamiento de quimioterapia a base de platino Campo de la invención La presente invención se refiere al campo del diagnóstico, en particular, a un procedimiento para predecir la supervivencia de pacientes con carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM) , basado en el patrón de metilación del gen 14-3-3 sigma. También se refiere al uso de agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de pacientes con CPNM.

Antecedentes de la invención

El cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa aproximadamente el 80 % de todos los cánceres de pulmón, con 1, 2 millones de casos nuevos cada año en todo el mundo. El CPNM dio lugar a más de un millón de muertes en todo el mundo en 2001 y es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer tanto en hombres como en mujeres (31 % y 25 %, respectivamente) . El pronóstico del CPNM avanzado, es pésimo. Un ensayo reciente del Eastern Cooperative Oncology Group de 1.155 pacientes no mostró diferencias entre las quimioterapias usadas: cisplatino/paclitaxel, cisplatino/gemcitabina, cisplatino/docetaxel y carboplatino/paclitaxel. El tiempo medio global hasta la progresión fue de 3, 6 meses y la supervivencia media fue de 7, 9 meses, una tasa de supervivencia al año del 33 % y una tasa de supervivencia a los 2 años del 11 por ciento. Un estudio aleatorizado más reciente de 1.218 pacientes informó de una media de supervivencia de 11 meses en pacientes en estadio IIIB-IV. Sin embargo, ningún parámetro clínico puede representar completamente las sorprendentes diferencias en la supervivencia entre pacientes con enfermedad avanzada, sobreviviendo algunos durante años y otros sólo unos pocos meses.

La supervivencia global a los cinco años de pacientes con CPNM ha permanecido en niveles inferiores al 15 % durante los últimos 20 años. La estadificación TNM (T = tumor primario; N = ganglios linfáticos regionales; M = metástasis a distancia) de subgrupos permite la identificación de grupos de pacientes con pronóstico y opciones de tratamiento similares. La supervivencia a los cinco años es de alrededor del 25 % para el estadio patológico IIB (T12N1M0, T3N0M0) , del 13 % para el estadio IIIA (T3N1M0, T1-2-3N2M0) y un bajo 7 % para el estadio IIIB (T4N0-12M0) .

Actualmente, el cisplatino (DDP) y el carboplatino se encuentran entre los fármacos antineoplásicos de uso más extendido. Sin embargo, la resistencia a estos fármacos a través de mecanismos de novo o inducidos socava su potencial curativo. Estos fármacos alteran la estructura del ADN a través de la formación de aductos intracatenarios. Se ha atribuido la resistencia a agentes de platino tales como el DDP a la tolerancia potenciada a aductos de platino, la acumulación reducida de fármacos o la reparación de ADN potenciada.

El 14-3-30 es un miembro de la superfamilia 14-3-3 que es responsable del punto de control G2 del ciclo celular en respuesta al daño del ADN en células humanas. Su función se ha analizado en la línea celular de cáncer colorrectal humano HCT116 (que expresa 14-3-30 y p53 natural) . Después de irradiación ionizante, 14-3-30 secuestró complejos de Cdc2/ciclina B1 en el citoplasma, deteniendo de este modo las células en G2 y evitando que inicien la mitosis antes de reparar su ADN dañado. Las células de carcinoma de colon carentes de 14-3-30 tratadas con adriamicina pueden aun así iniciar (pero no mantener) la detención en G2, conduciendo a la catástrofe mitótica y la muerte celular. La expresión de 14-3-30 se reduce por la inactivación del gen p53 y mediante el silenciamiento del gen 14-3-30 a través de la metilación de islas CpG.

14. 3-30 fue indetectable en muestras de cáncer de mama mediante análisis proteómico y la hipermetilación de islas CpG no metiladas normalmente en la región promotora del 14-3-30 se implicó en el silenciamiento génico en la transcripción en cánceres de mama (Ferguson AL, Evron E, Umbricht CB, y col.: High frequency of hypermethylation at the 14-3-3 sigma locus leads to gene silencing in breast cancer. Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2000;97:6049-54) . Se ha informado de efectos similares de hipermetilación de 14-3-30 en muchos tumores, incluyendo carcinomas de pulmón, gástrico, ovárico, de próstata y hepatocelular.

Se sabe que, con frecuencia, se encuentran fragmentos de ADN bicatenario en cantidades considerables en el suero de pacientes con cáncer, encontrándose niveles significativamente más altos en el suero de pacientes con metástasis. En cánceres de la cabeza y el cuello, microcíticos de pulmón y no microcíticos de pulmón, las mismas alteraciones de microsatélite detectadas en el tumor también se encontraron en ADN sérico o en plasma (Sánchez-Céspedes M, Monzo M, Rosell R, y col. Detection of chromosome 3p alterations in serum DNA of non-small-cell lung cancer patients. Ann Oncol 1998;9:113-6; Sozzi G, Musso-K, Ratcliffe C, Goldstraw P, Pierotti MA, Pastorino U. Detection of microsatellite alterations in plasma DNA of non-small cell lung cancer patients: a prospect for early diagnosis. Clin Cancer Res 1999;5:2689-92) . Además, se informó por primera vez de la detección de hipermetilación en las regiones promotoras de genes supresores de tumores en el suero de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico. La hipermetilación puede analizarse mediante el ensayo sensible de reacción en cadena de la polimerasa específico de metilación, que puede identificar un alelo metilado entre 1000 alelos no metilados (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci EE. UU. 1996;93:9821-6) .

Sathyanarayana y col. (Cancer Genomics & Proteomics, 2004, 1:1-8) divulgan que el gen 14-3-3 sigma estaba hipermetilado en CPNM y que este efecto podría usarse en el análisis y el pronóstico del cáncer.

Se descubrió que el 14-3-3 0 estaba metilado en el 43 por ciento de 60 cánceres gástricos y que las líneas celulares gástricas humanas positivas para metilación de 14-3-30 MKN74 (con p53 natural) y MICN28 (con p53 mutado) eran ambas altamente sensibles a adriamicina, mientras que las líneas celulares negativas para metilación de 14-3-30 (con p53 natural o o mutado) eran resistentes.

Aunque no puede lograrse un impacto global importante con la quimioterapia tradicional en CPNM, como se explica anteriormente, es evidente que la quimiosensibilidad y, por tanto, la supervivencia se determina de manera individual. No obstante, a pesar de la lista creciente de anomalías genéticas identificadas como implicadas en rutas de reparación del ADN y de la quimiosensibilidad alterada en pacientes con CPNM, todavía no se han desarrollado ensayos traduccionales para su uso en quimioterapia individualizada.

Es un objeto de la presente invención proporcionar predictores de respuesta a quimioterapia, que pueden ser una herramienta clínica valiosa para su uso en la selección de modos de tratamiento óptimos, en particular para pacientes como los que padecen CPNM, con una tasa de supervivencia tan baja y una quimiosensibilidad impredecible.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una herramienta para su uso en la predicción de la supervivencia diferencial y la quimiosensibilidad y en la adaptación de la quimioterapia en CPNM.

La resistencia a fármacos es un acontecimiento complejo y con numerosos factores que implica la activación/represión de múltiples rutas bioquímicas. Empleamos un enfoque proteómico para estudiar la respuesta a fármaco y la resistencia a cisplatino. Partiendo del supuesto de que los defectos en los puntos de control del ciclo celular pueden contribuir a la quimiosensibilidad, investigamos si los pacientes con tumores positivos para metilación de 143-30 podrían obtener mayores beneficios de la quimioterapia a base de cisplatino o carboplatino.

Sorprendentemente, descubrimos que 14-3-30 está metilado en los sueros de un tercio de los pacientes con cáncer de pulmón microcítico y que, en general, la metilación está relacionada con una supervivencia media significativamente mejor para estos pacientes. Además, la metilación de 14-3-30 tenía una influencia incluso mayor sobre la supervivencia en pacientes con respuesta. El riesgo de muerte para pacientes con respuesta negativos para metilación de 14-3-30 fue casi cinco veces la de los pacientes con respuesta positivos para metilación.

En un aspecto, se divulga un procedimiento in vitro para predecir la supervivencia después de quimioterapia a base de cisplatino o carboplatino... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para predecir la supervivencia de un paciente que padece CPNM a un tratamiento de quimioterapia a base de cisplatino o carboplatino y proporcionar una respuesta completa o parcial a la quimioterapia a base de cisplatino o carboplatino, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de determinar el estado de metilación de un ácido nucleico que codifica 14-3-3 sigma en una muestra biológica del paciente, en el que la presencia de metilación es indicativa de una mayor supervivencia de dicho paciente como una respuesta a dicho tratamiento de quimioterapia.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el estado de metilación del ácido nucleico se determina en la región reguladora del ácido nucleico.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que región reguladora es la región promotora o el exón 1 del gen 14-33 sigma.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el estado de metilación del ácido nucleico se determina en la región entre los dinucleótidos de CpG 3 y 9 dentro del gen 14-3-3 sigma.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el que la muestra biológica es una muestra de tumor del paciente.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el que la muestra biológica es una muestra de suero del paciente.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la quimioterapia a base de cisplatino o carboplatino se selecciona de entre cisplatino o carboplatino como agentes únicos o una combinación seleccionada de entre cisplatino/paclitaxel, cisplatino/gemcitabina, cisplatino/docetaxel y carboplatino/paclitaxel.

8. Procedimiento para diseñar un tratamiento de quimioterapia individual a base de cisplatino o carboplatino para un sujeto que padece CPNM y proporcionar una respuesta completa o parcial a la quimioterapia a base de cisplatino o carboplatino, comprendiendo dicho procedimiento:

i) determinar el estado de metilación de un ácido nucleico que codifica 14-3-3 sigma en una muestra biológica del paciente;

ii) tener en cuenta los datos obtenidos en la etapa anterior para diseñar un tratamiento de quimioterapia individual, de manera que la presencia de metilación es indicativa de la predisposición del paciente a tener un tiempo de supervivencia mayor con un tratamiento de quimioterapia que comprende cisplatino o carboplatino.

9. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 u 8 en el que la muestra es una muestra de sangre.

10. Uso de un kit que comprende un primer recipiente que contiene un reactivo que modifica citosina no metilada y un segundo recipiente que contiene cebadores para la amplificación de un ácido nucleico del gen 14-3-3 sigma que contiene CpG, en el que los cebadores distinguen entre ácido nucleico no metilado y metilado modificado, para predecir la supervivencia a un tratamiento de quimioterapia a base de cisplatino o carboplatino de un paciente con CPNM.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los cebadores usados en el kit pertenecen a la región promotora de 14-3-30.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los cebadores usados en el kit pertenecen a la región entre los dinucleótidos de CpG 3 y 9 dentro del gen 14-3-30.

13. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 12 en el que el reactivo que modifica citosina no metilada es bisulfito.

FIGURA 1

FIGURA 2