Polinucleótidos para la amplificación y detección de neisseria gonorrhoeae.

Las muestras del auxotipo de NG estuvieron presentes en las mezclas de reacción a concentraciones finales en elintervalo de 10-1000 moléculas por reacción.

Cada mezcla de reacción comprendía una concentración final de 0,40uM de cebador directo de CT (SEQ ID NO: 1), 0,20 uM de cebador inverso de CT (SEQ ID NO: 4), 0,10 uM sondabaliza de CT (SEQ ID NO: 7), 0,20 uM de cebador directo de NG (SEQ ID NO: 8), 0,20 uM de cebador inverso deNG (SEQ ID NO: 9), 0,10 uM sonda baliza de NG (SEQ ID NO: 12), 3 unidades de ADN polimerasa AmpliTaq,dNTPs 1 mM, y MgCl2 8 mM en Tampón 1x PCR II. La reacciones se sometieron a ciclación 45 veces a 95ºC/30 segy 59ºC/1 min para la amplificación del ADN, seguido por 1 ciclo a 95ºC/3 min y 25ºC/10 min para la desnaturalizaciónfinal y el recocido de la sonda.

Se sometieron a ensayo 6 auxotipos de NG, y todos los auxotipos sometidos a ensayo se detectaron con altasensibilidad (10 copias por reacción), utilizando los conjuntos de cebador/sonda de la invención. Además, no seobservó reactividad cruzada con el conjunto de cebador de CT incluso cuando estaba presente NG a una altaconcentración (107 moléculas de NG por reacción).

Polinucleótidos para la Amplificación y Detección de Neisseria gonorrhoeae Campo de la invención La presente invención se refiere a Neisseria gonorrhoeae. En particular, la invención se refiere a una composición de polinucleótidos y métodos para amplificar y detectar Neisseria gonorrhoeae.

Antecedentes de la Invención Chlamydia trachomatis (C. trachomatis o M y Neisseria gonorrhoeae (N. gonorrhoeae o NG) son los agentes causantes de enfermedades comunes de transmisión sexual. La CT causa el linfogranuloma venéreo, diversas patologías inflamatorias de los sistemas urogenitales masculinos y femeninos, y el tracoma, una enfermedad crónica que afecta a 500 millones de personas y puede llevar a la ceguera. Cuando no se diagnostica precozmente y se trata mediante la terapia adecuada, la uretritis y la cervicitis inducidas por CT pueden conducir a una variedad de inflamaciones crónicas, tales, como, por ejemplo, vaginitis, salpingitis e inflamación pélvica que pueden dar como resultado esterilidad y embarazo extrauterino. Además, los recién nacidos de madres infectadas pueden contraer infecciones pulmonares y/u oculares durante el parto.

N. gonorrhoeae, el patógeno de la gonorrea, se manifiesta como una inflamación purulenta e hinchazón de la uretra en los hombres. Estos síntomas se producen en 90% de los casos de infección. Si se deja sin tratamiento, la infección puede ascender y después de varias semanas producir síntomas de prostatitis. En las mujeres, no se producen o sólo se producen síntomas leves en 50% de los casos de infección. La infección afecta principalmente al cérvix, pero también a la uretra. En 10 y 15% de las mujeres, la infección se disemina a las trompas de Falopio y también puede conducir a esterilidad. Dado que el curso de las infecciones a menudo es asintomático, muchos portadores contribuir sin saberlo a la propagación de la enfermedad.

Teniendo en cuenta el impacto que tienen estos dos organismos, las pruebas de diagnóstico rápido y específico son de suma importancia. El diagnóstico basado en el crecimiento selectivo de las bacterias patogénicas ha sido la norma, pero el cultivo de células consume mucho tiempo y muchos productos aislados clínicos son difíciles de cultivar in vitro. La infección con bacterias da como resultado la formación de una variedad de anticuerpos con serogrupo, especie, subespecie, serovariedad (serotipo) y especificidad de auxotipo. Los sueros de pacientes con infecciones del tracto genital se han utilizado para diagnosticar la infección por CT y NG, sin embargo los ensayos basados en marcas serológicos son por naturaleza no cuantitativos y están sujetos a dificultades en la interpretación. Por ejemplo, los títulos de anticuerpos pueden ser indetectables en infecciones agudas (falso negativo) , pueden persistir en individuos no infectados con una historia pasada de infección (falso positivo) , pueden producir una indicación de falso positivo debido a la presencia de especies de reacción cruzada (por ejemplo, infección respiratoria por diferentes especies de Chlamydia) , o pueden no desarrollarse en absoluto (falso negativo) dependiendo de otros factores (Ngeow, 1996, Ann Acad Med 25:300 Singapur; Black et al., 1991, J Clin Microbiol 29:1312) . Por estas razones, la serología sola no es adecuada para el diagnóstico de las infecciones por CT y NG.

Las infecciones bacterianas también pueden ser diagnosticadas mediante la detección de secuencias de ácidos nucleicos particulares para el organismo infeccioso. Dependiendo de la secuencia de ácido nucleico seleccionada para la detección, un ensayo diagnóstico puede ser específico para un género entero, más de un género, una especie o subespecie, auxotipo, serovariedad (serotipo) , cepa u otro subconjunto de organismos. Esta selectividad puede ser explotada en el desarrollo de ensayos diagnósticos fiables sencillos de las especies C. trachomatis yN. gonorrhoeae de patógenos bacterianos.

El documento EP 0 919 633 A2 describe métodos para detectar la presencia de Neisseria gonorrhoeae a través de la detección de su genoma amplificado. También se describe un conjunto de oligonucleótidos que se van a utilizar como cebadores para la amplificación del genoma de N. gonorrhoeae y como sondas para la detección de tal genoma amplificado.

El documento US 5 550 040 A describe métodos, reactivos y kits para la amplificación simultánea y la detección de secuencias de nucleótidos de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae. En particular, se describen los cebadores para la amplificación del genoma de N. gonorrhoeae y una sonda para la detección de tal genoma amplificado.

En el documento US 5 453 355 A, se describen métodos para detectar N. gonorrhoeae mediante la amplificación de su genoma a través de la PCR. También se describen las secuencias de nucleótidos adecuadas como cebadores específicos para la amplificación del gen de pilina y sondas para su detección. El documento WO 93/00447 se dirige a la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos diana reacción en cadena de la ligasa para el relleno de espacios. En particular, se describen los oligonucleótidos que se van a utilizar como cebadores para la amplificación genómica que mapean en el gen de la opacidad (opa) de N. gonorrhoeae.

La inscripción Núm. X52368.1 de la base de datos GenBank Bhat, K.S. et al. "gen opaF de N. gonorrhoeae para la proteína de opacidad" describe la secuencia de nucleótidos del gen opaF de N. gonorrhoeae.

Esta información de antecedentes se proporciona con el propósito de dar a conocer la información que solicitante cree que tiene posible relevancia para la presente invención. No se pretende admitir necesariamente, ni se debe considerar, que cualquiera de la información precedente constituye técnica anterior contra la presente invención.

Compendio de la invención La presente invención proporciona reactivos polinucleotídicos útiles para la detección de Neisseria gonorrhoeae. En particular, la presente invención proporciona cebadores y sondas para los procedimientos de amplificación y detección de ácido nucleico, que detectan específicamente y con sensibilidad varias subespecies o serotipos y auxotipos de N. gonorrhoeae.

La presente invención proporciona una composición de reactivos polinucleotídicos que comprende polinucleótidos que consisten en las secuencias de los SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10.

La presente invención también proporciona un método de amplificación de Neisseria gonorrhoeae en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho método:

1. (a) formar una mezcla de reacción que comprende reactivos de amplificación de ácidos nucleicos, una muestra de ensayo que contiene potencialmente una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae, y una composición de reactivos polinucleotídicos como se define anteriormente, y

2. (B) someter la mezcla a condiciones de amplificación para generar al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana.

Además, la presente invención proporciona un método para detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho método:

(a) formar una mezcla de reacción que comprende reactivos para la reacción de amplificación de ácidos nucleicos, una muestra de ensayo que contiene potencialmente una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae, y al menos una composición de reactivos polinucleotídicos como se ha definido anteriormente;

(b) someter la mezcla a condiciones de amplificación para generar al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana;

(c) hibridar la sonda a la secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana, para formar un híbrido que comprende la sonda y la secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana; y

(d) detectar el híbrido como una indicación de la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra de ensayo.

Además, la presente invención proporciona un kit que comprende:

(a) al menos tres polinucleótidos que comprenden secuencias que consisten en el SEQ ID NO: 8, el SEQ ID NO: 9, yel SEQ IDNO: 10, y

(b) reactivos de amplificación.

Además, cuando la amplificación es mediante PCR o un procedimiento de amplificación mediante termociclación similar, la etapa (b) puede repetirse varias veces para aumentar el número de copias de la secuencia diana.

Los polinucleótidos utilizados en la presente invención también se pueden proporcionar como parte de un kit útil para amplificar y/o detectar N. gonorrhoeae. Los kits pueden comprender uno o más recipientes adecuados que contienen una composición de acuerdo con la presente... [Seguir leyendo]

1. Una combinación de reactivos polinucleotídicos que comprende polinucleótidos que consisten en las secuencias del SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10. 5

2. Un método para amplificar una muestra de ensayo de Neisseria gonorrhoeae comprendiendo dicho método:

(a) formar una mezcla de reacción que comprende reactivos de amplificación de ácidos nucleicos, una muestra de ensayo que contiene potencialmente una secuencia diana Neisseria gonorrhoeae, y una combinación según la reivindicación 1; y

(b) someter la mezcla a condiciones de amplificación para generar al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana.

3. El método de la reivindicación 2, en el que las condiciones de amplificación incluyen cambiar la temperatura de la muestra y el cambio de temperatura se repite entre 10 y 100 veces. 15

4. Un método de detección de Neisseria gonorrhoeae en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho método:

(a) formar una mezcla de reacción que comprende reactivos de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos, una muestra de ensayo que contiene potencialmente una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae, y al menos una combinación de acuerdo con la reivindicación 1;

(b) someter la mezcla a condiciones de amplificación para generar al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana;

(c) hibridar la sonda a la secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana, para formar un híbrido que comprende la sonda y la secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia diana; y

(d) detectar el híbrido como una indicación de la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra de ensayo. 25

5. Un kit que comprende:

(a) al menos tres secuencias que comprenden polinucleótidos que consisten en el SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10, y

(b) reactivos de amplificación. 30

6. La combinación de reactivos polinucleotídicos de la reivindicación 1, en la que uno o más de los polinucleótidos incorporan uno o más marcas detectables.

7. El kit de la reivindicación 5, donde uno o más de los polinucleótidos incorporan una o más marcas detectables. 35