Polímeros impresos molecularmente selectivos para nitrosaminas y procedimientos para usarlos.

Un polímero impreso molecularmente selectivo al menos para una nitrosamina específica de tabaco,

en el que dicho polímero impreso molecularmente se obtiene usando como plantilla un análogo funcional o estructural de una nitrosamina específica de tabaco.

Polímeros impresos molecularmente selectivos para nitrosaminas y procedimientos para usarlos.

Campo de la invención La presente invención se refiere a una clase de polímeros impresos molecularmente y al uso de polímeros impresos molecularmente en bioanalisis y separación de metabolitos de nicotina. La invención se refiere ademas a procedimientos para usar los polímeros impresos molecularmente para tratar tabaco, sustitutos de tabaco, y sus derivados para reducir en los mismos el nivel de compuestos que se consideran dianas.

Antecedentes de la invención En los campos de las ciencias medicas, nutricionales, medioambientales y químicas hay necesidad creciente de realizar alguna separación selectiva de sustancias específicas en mezclas complejas de sustancias emparentadas. El objetivo puede ser la extracción cuantitativa de cierto compuesto o compuestos, la medición de su concentración, o la retirada selectiva de un compuesto diana de una mezcla multicomponente.

Unos controles sanitarios mas estrictos han hecho subir la demanda de procedimientos que permitan la cuantificación sensible y selectiva de productos peligrosos y metabolitos de ciertas sustancias cuotidianas de uso ampliamente extendido. De particular interes son los compuestos químicos emparentados con el uso de productos a base de tabaco, compuestos que estan presentes originalmente en la propia hoja de tabaco de partida o que se generan durante el acto de fumar. Se considera que los compuestos que contienen algun grupo nitroso, tales como las nitrosaminas, son de especial significación a este respecto.

Con el objetivo de reducir la incidencia de los peligros de fumar, se han elaborado ciertos productos farmaceuticos que contienen solo la sustancia neuroactiva, nicotina, la sustancia química que se reivindica que es responsable de los aspectos de dependencia del material fumable.

Entre las formulaciones de nicotina en terapias para dejar de fumar, el chicle de nicotina ha encontrado el uso mas ampliamente extendido. El control de calidad que se requiere durante su producción incluye vigilar el nivel de nicotina (2 a 4 mg por pieza de chicle) así como vigilar los productos primarios de oxidación de nicotina, cotinina, miosmina, cis-N-6xido de nicotina, trans-N-6xido de nicotina y beta-nicotirina. Tambien es deseable, cuando no exigida, la cuantificación de nornicotina, anatabina y anabasina. Segun la Farmacopea de EE.UU. (U.S.P.) la formulación del chicle deberfa contener entre 95% y 110% de la cantidad de nicotina declarada en la etiqueta y la cantidad de cada producto de oxidación no deberfa exceder de 0, 1% de la cantidad de nicotina.

A pesar del uso de sustitutos de cigarrillos de este tipo, se pueden producir en vivo metabolitos de nicotina como nitrosamina por procesos metabólicos naturales durante la residencia de la nicotina dentro de los tejidos corporales. Los niveles de estos metabolitos se mantienen por debajo de las concentraciones a las que la mayoría de los procedimientos analfticos se pueden llevar a cabo cuantitativamente. Por lo tanto la necesidad de procesos que sean capaces de vigilar estos niveles, así como los niveles de otros metabolitos de nicotina, es de importancia. Tfpicamente, dicha vigilancia se lleva a cabo sobre muestras de orina humana en las que los niveles de tales sustancias carcin6genas sospechosas son extremadamente bajos.

Los compuestos que se consideran diana para cuantificación, reducción o retirada de tabaco o humo son conocidos e incluyen los componentes principales de nitrosaminas específicas del tabaco (TSNAs) y sus precursores alcaloides: NNK, 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona; NNA, 4- (metilnitrosamino) -4- (3-piridil) butanal; NNN, Nnitrosonornicotina; NAB, N-nitrosoanabasina; NAT, N-nitrosoanatabina; NNAL, 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil-1butanol; iso-NNAL, 4- (metilnitrosamino) -4- (3-piridil-1-butanol; iso-NNAC, acido 4- (metilnitrosamino) -4- (3piridil) butanoico.

Para cuantificar apropiadamente cuanto de cada compuesto que se considera diana esta presente en los fluidos biológicos humanos, se estan desarrollando procedimientos para analizar en el tabaco los alcaloides, especialmente los productos y metabolitos de descomposición nitrosilados. Los procedimientos existentes de separación cromatografica o extracción usados para este analisis carecen de la robustez, sensibilidad y velocidad requeridas para manejar el gran numero de muestras que se genera cuando se estudia una población general. Con los procedimientos existentes, la baja concentración de nitrosaminas, que estan típicamente presentes en picogramos por mililitro, demanda una considerable preparación de la muestra con extracciones multietapa y a menudo derivatización química (por ejemplo deuterización previa a espectrometrfa de masas) del analito previa al analisis. Una razón de esta complejidad es que los materiales de separación existentes no son selectivos como, por ejemplo, un anticuerpo o receptor biológico puede ser para los metabolitos en cuestión sino que se basan mas bien en propiedades fisicoquímicas como la carga o la hidrofobia de los metabolitos para el comportamiento de separación. Estas propiedades químicas se pueden compartir con otras muchas moleculas irrelevantes en la muestra.

Un procedimiento típico podría implicar hasta siete etapas de trabajo que incluyen centrifugaciones, ajustes de pH, tratamientos enzimaticos, etc., que pueden sumar hasta un tiempo de preparación de muchas horas o incluso días

por muestra. Con procedimientos tan engorrosos, la perdida de material durante el proceso puede conducir a errores en la estimación de las concentraciones de la muestra original, que requieren extrapolación por retroceso de la medida final, en lugar de depender de una medición directa, para obtener la concentración en la muestra original. Por lo tanto, un procedimiento rapido y sencillo para el analisis de nitrosaminas específicas de tabaco es una significativa necesidad analftica medica sin satisfacer. (Veanse, por ejemplo Byrd & Ogden, Journal of Mass Spectrometr y , 2003, 38, 98-107 y Wu y col., Anal. Chem. 2003, 75, 4827-4832) .

En los ultimos anos, han aparecido numerosos informes sobre reconocimiento selectivo de moleculas pequenas con materiales preparados por impresión molecular (polímeros impresos molecularmente o MIP) . Vease, por ejemplo, Wulff, G. Angew, Chemie. Int. Ed. Engl. 1995 (34) 1812. Los MIP son polímeros que tienen sitios reactivos adaptados para unirse selectivamente con compuestos que se consideran dianas. Se han usado materiales impresos molecularmente preparados de modo covalente, para reconocimiento de quiral de diversas moleculas pequenas que incluyen farmacos terapeuticos, azucares, bases de nucleótidos, y plaguicidas, así como hormonas esteroideas y peptfdicas. Ejemplos de los mismos se describen, por ejemplo, en Sellergren, B. Trends Anal. Chem. 1997 (16) 310. La afinidad y la selectividad altas para el analito diana que exhiben algunos de los materiales impresos han justificado la comparación con las correspondientes fases de la inmuno-afinidad (IA) . Sin embargo, en contraste con estas ultimas fases, los materiales MIP son directos de preparar, estables en la mayoría de los medios y reutilizables a lo largo de prolongados perfodos de tiempo.

Por lo tanto, estan bajo investigación aplicaciones de los materiales de MIP en cromatograffa, separación (continua o por lotes) , detección química o en analisis específicos.

Otra aplicación es la extracción en fase sólida (SPE, vease Mayes, A. G.; Mosbach, K. Trends Anal. Chem. 1997, 16, 321) de analitos presentes en concentraciones bajas en muestras biológicas, o en matrices complejas. La SPE puede conducir a enriquecimiento selectivo y limpieza de analito hasta niveles no alcanzables con los procedimientos existentes. Las extracciones en fase sólida impresa molecularmente (MISPE) se han usado en bioanalisis, analisis de alimentos y analisis medioambiental. En estos ejemplos se obtiene enriquecimiento selectivo y limpieza del analito lo que da como resultado una precisión mas alta y un descenso del límite de detección (LOD) en la posterior cuantificación cromatografica (por ejemplo HPLC) o por espectrometrfa de masas.

En vista de su alta selectividad combinada con buena afinidad para la molecula diana o el grupo de moleculas diana, los MIP han despertado un considerable interes por parte de la industria alimentaria como herramienta para mejorar la calidad de los alimentos. Esto requiere el uso de MIP para la retirada selectiva de componentes indeseables de la matriz... [Seguir leyendo]

1. Un polímero impreso molecularmente selectivo al menos para una nitrosamina específica de tabaco, en el que dicho polímero impreso molecularmente se obtiene usando como plantilla un analogo funcional o estructural de una nitrosamina específica de tabaco.

2. Un polímero impreso molecularmente segun la reivindicación 1, en el que dicha al menos una nitrosamina se deriva de nicotina, nornicotina, anabasina o anatabina.

3. Un polímero impreso molecularmente segun la reivindicación 1, selectivo para la nitrosamina NNAL derivada de nicotina.

4. Un polímero impreso molecularmente segun la reivindicación 1, en el que el polímero se ha preparado usando como plantilla un analogo isosterico de una nitrosamina de nicotina.

5. Un polímero impreso molecularmente segun la reivindicación 1, en el que el polímero se ha preparado usando como plantilla 4- (metilpropenil-amino) -1-piridin-3-il-butan-1-ol.

6. Un polímero impreso molecularmente segun la reivindicación 1, en el que el polímero se ha preparado usando como plantilla piridincarbinol.

7. Un polímero impreso molecularmente segun la reivindicación 1, en el que el polímero se ha preparado usando un compuesto que incluye una subestructura de la nitrosamina específica de tabaco.

8. Un kit que comprende: un polímero impreso molecularmente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7; e instrucciones de uso del polímero impreso molecularmente para que realice al menos una de las acciones

de detectar, cuantificar, y separar nitrosaminas en una muestra.

9. Un procedimiento para preparar un polímero impreso molecularmente, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende:

copolimerizar al menos un monómero funcional y al menos un reticulador en presencia de al menos un analogo funcional o estructural de una nitrosamina específica de tabaco en un medio de polimerización que contiene al menos un iniciador de radicales libres para producir un polímero impreso molecularmente unido a un analogo funcional o estructural de una nitrosamina específica de tabaco; y retirar dicho analogo funcional o estructural de una nitrosamina específica de tabaco del polímero impreso molecularmente.

10. Un procedimiento segun la reivindicación 9, en el que el monómero funcional exhibe funcionalidad de acido.

11. Un procedimiento segun la reivindicación 9, en el que el monómero funcional se selecciona entre el grupo que consiste en acido metacrflico (MAA) , TFMAA, acido vinilbenzoico, y acido itacónico.

12. Un procedimiento segun la reivindicación 9, en el que el reticulador se selecciona entre el grupo que consiste en dimetacrilato de etilenglicol (EDMA) , trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM) y tetraacrilato de pentaeritritol.

13. Un procedimiento segun la reivindicación 9, en el que el analogo estructural se selecciona entre el grupo que consiste en 4- (metilpropenil-amino) -1-piridin-3-il-butan-1-ol (4MPAPB) y piridincarbinol.

14. Un procedimiento para preparar un polímero impreso molecularmente, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende:

copolimerizar una mezcla de polimerización y al menos un analogo funcional o estructural de una nitrosamina específica de tabaco en un medio de reacción homogeneo; y recuperar las partfculas suspendidas del medio de reacción.

15. Un procedimiento para preparar un polímero impreso molecularmente, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende:

copolimerizar una mezcla de polimerización y al menos un analogo funcional o estructural de una nitrosamina específica de tabaco en un medio de reacción heterogeneo; y recuperar el material polimerizado del medio de reacción heterogeneo.

16. Un procedimiento para determinar si un producto de tabaco contiene nitrosaminas, que comprende:

hacer que reaccione la muestra con un polímero impreso molecularmente, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en condiciones que permitan que se unan las nitrosaminas presentes en la muestra al polímero impreso molecularmente; y evaluar si el polímero impreso molecularmente se ha unido a algunas nitrosaminas, en el que la evaluación que da como resultado la observación del polímero impreso molecularmente unido a nitrosaminas indica que la muestra contiene nitrosaminas.

17. Un procedimiento para cuantificar la cantidad de nitrosaminas en un producto de tabaco, que comprende:

hacer que reaccione la muestra con un polímero impreso molecularmente, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en condiciones que permitan que se unan las nitrosaminas presentes en la muestra al polímero impreso molecularmente; y medir la cantidad de nitrosaminas unidas al polímero impreso molecularmente.

18. Un procedimiento para tratar un producto de tabaco para reducir el nivel de un componente del mismo que se considera diana que comprende tratar el producto de tabaco con un polímero impreso molecularmente, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

19. Un procedimiento segun la reivindicación 18, en el que el producto de tabaco se produce por descomposición termica de un material que contiene tabaco, un sustituto de tabaco o una mezcla de los mismos.

20. Un procedimiento segun la reivindicación 19, en el que el producto de tabaco se produce calentando el material a una temperatura por debajo de su temperatura de combustión.

21. Un procedimiento segun la reivindicación 19 o la 20, en el que el producto de tabaco se produce por combustión del material.

22. Un procedimiento segun la reivindicación 18, en el que el producto de tabaco se produce poniendo en contacto un material que contiene tabaco, un sustituto de tabaco o una mezcla de los mismos con un disolvente.

23. Un procedimiento para fabricar un material de tabaco, que comprende las etapas de:

extraer un material que contiene tabaco, sustituto de tabaco o una mezcla de los mismos con un disolvente;

poner en contacto el extracto con un polímero impreso molecularmente, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, de modo que reduzca el nivel de un compuesto que se considera diana en el extracto, y combinar el extracto tratado con el material de tabaco extrafdo.

24. Un artfculo para fumar, que comprende:

un material para fumar; y un polímero impreso molecularmente, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, selectivo al menos para una nitrosamina específica de tabaco que se encuentra en los productos de descomposición termica del material para fumar.

25. Un artfculo para fumar, segun la reivindicación 24, en el que el polímero impreso molecularmente es selectivo al menos para una nitrosamina volatil que se encuentra en la fase vapor de los productos de descomposición termica del material para fumar.

26. Un filtro para el humo, que comprende un polímero impreso molecularmente, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

27. Un filtro para el humo segun la reivindicación 26, en el que el polímero impreso molecularmente es selectivo al menos para una nitrosamina volatil que se encuentra en la fase vapor de los productos de descomposición termica de tabaco o de un sustituto de tabaco.