Un análogo de péptido de factor motoneuronotrófico de una longitud de 6 a 32 amino ácidos,

conteniendo dicho análogo de péptido una secuencia de amino ácido seleccionada del grupo consistente en:

(a) NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:2; y

(b) NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:3

En el que dicho análogo de péptido incrementa la viabilidad de neuronas motoras.

Peptidos y compuestos de factores troficos de motoneuronas y sus procedimientos de utilizacion

ANTECEDENTES

Los Factores Neurotróficos (FNTs) son un grupo especializado de proteínas con la función de promover la supervivencia, crecimiento, mantenimiento y capacidades funcionales de poblaciones selectas de neuronas. Recientes estudios han demostrado que la muerte neuronal tiene lugar en los sistemas nerviosos de vertebrados durante ciertos períodos de crecimiento y desarrollo. Sin embargo, la adición factores tróficos neuronales solubles de tejidos objeto asociados sirve para paliar este fenómeno de la muerte neuronal. Las siguientes citas discuten sobre factores tróficos neuronales: Chau, R.M.W., et al., Neuronotrophic Factor, 6 Chin. Neuroanatomy 129 (1990) ; Kuno, M., Target Dependence of Motoneuronal Survival: The Current Status, 9 Neurosci. Rres. 155 (1960) ; Bard, Y.A., Trophic Factors and Neuronal Survival, 2 Neuron 1525 (1989) ; Oppenheim, R.W., The Neurotrophic Theor y and Naturally Occurring Motoneuron Death, 12 TINS 252 (1989) ; Bard, Y.A., What, If Anything, is a Neurotrophic Factor?, 11 TINS 343 (1988) ; y Thoenen, H., y Edgard, D., Neurotrophic Factors, 229 Science 238 (1985) .

En el sistema neuromuscular vertebrado, se ha comprobado que la supervivencia de motoneuronas embriónicas es dependiente de sustancias tróficas específicas derivadas de los músculos esqueléticos. Se ha comprobado, tanto es estudios in vivo como in vitro, que los músculos esqueléticos producen sustancias capaces de fortalecer la supervivencia y desarrollo de motoneuronas al impedir la degeneración y subsiguiente muerte celular natural de las motoneuronas embriónicas. Ver O'Brian, R.J. y Fischbach, G.D., Isolation of Embr y onic Chick Motoneurons and Their Survival In Vitro, 6 J. Neurosci. 3265 (1986) ; Hollyday, M. y Hamburger, V., Reduction of the Naturally Occurring Motor Neuron Loss by Enlargement of the Peripher y , 170 J. Comp. Neurol. 311 (1976) . De forma similar, diversos investigadores han informado que los músculos esqueléticos de polluelos y ratas poseen ciertos factores tróficos que pueden impedir la muerte celular natural de motoneuronas embriónicas tanto in vivo como in vitro. Ver McManaman, J.L., et al., Purification of a Skeletal Muscle Polypeptide Which Stimulates Choline Acetyltransferase Activity in Cultured Spinal Cord Neurons, 263 J. Biol. Chem. 5890 (1988) ; Oppenheim, R.W., et al., Reduction of Naturally Occurring Motoneuron Death In Vitro by a Target Derived Neurotrophic Factor, 240 Science 919 (1988) ; y Smith, R.G., et al., Selective Effects of Skeletal Muscle Extract Fractions on Motoneurons Development In Vivo, 6 J. Neurosci. 439 (1986) .

O'Lear y , P.D., et al., 1998, J. Neurochem., Vol. 70, No. 4, pp. 1712-1721, describen análogos de péptido con – formacionalmente constreñidos del bucle 2 del factor neurotrófico derivado del cerebro (FNDC) .

Longo, F.M., et al., 1990, Cell Regulation, Vol. 1, No. 2, pp. 189-196, describe péptidos sintéticos que se corresponden con tres regiones de factor de crecimiento nervioso (FCN) .

La patente estadounidense US 2002 086831 A1 describe un procedimiento de administración de factores motoneuronotróficos para promocionar la supervivencia, crecimiento, proliferación o mantenimiento de neuronas de mamíferos.

Adicionalmente, un polipéptido ha sido aislado del musculo esquelético de la rata del que se ha comprobado que incrementa, de forma selectiva, la supervivencia de motoneuronas embriónicas de polluelo in vivo, además de la actividad de acetiltransferasa colina en estas motoneuronas. Este polipéptido ha sido llamado Factor de Desarrollo de Colina Acetiltransferasa (FDC) y se ha demostrado que su función biológica es diferente de otros factores tróficos tales como Factor del Crecimiento del Nervio (FCN) , Factor Neurotrófico de Ganglio Ciliar (FNGC) , Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro (FNDC) , y Factor Neurotrófico de Ganglio Retinal (FNGR) . Ver Levi-Montalcini, R., “Developmental Neurobiology and the Natural Histor y of Nerve Growth Factor”, 5 Ann. Rev. Neurosci. 341 (1982) ; Varon, S., et al., Growth Factors. En: Advances in Neurology, Vol 47: Functional Recover y in Neurological Disease, Waxman, S.G. (ed.) , Raven Press, Nueva York, pp. 493-521 (1988) ; Barde, Y.A., Trophic Factors and Neuronal Survival, 2 Neuron 1525 (1989) ; Chau, R.M.W., et al., The Effect of a 30 kD Protein from Tectal Extract of Rat on Cultured Retinal Neurons, 34 Science in China, Series B, 908 (1991) .

El aislamiento y caracterización de dos factores motoneuronotróficos de tejido de músculo de rata que tengan pesos moleculares aparentes de 35 kD y 22 kD fueron informados por Chau et al. Ver Chau, R.M.W., et al., Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of Rat Spinal Cord.En: Recent Advances in Cellular and Molecular Biology, Vol. 5, Peeters Press, Leuven, Belgium, pp. 89-94 (1992) . La proteína 35 kD ha sido definida por el Dr. Chau como factor motoneuronotrófico 1 (FMNT1) y la proteína 22 kD aparente como factor motoneuronotrófico 2 (FMNT2) . Se ha demostrado in vitro que estos dos factores tróficos apoyan el crecimiento y/o regeneración de ambas motoneuronas del asta anterior aisladas y de explantes de médula espinal lumbar de rata.

Subsiguientemente, en 1993, Chau et al. Informaron de la exploración inmunológica de clones lambda gt11 de una genoteca de ADNc de retinoblastoma humano usando un anticuerpo monoclonal para FMNT1 como inmunoprobio. Unos inmunocoágulos de extractos de un clon inmunopositivo mancharon una proteína de FMNT1 que tenía un peso molecular aparente de 55 kD. Ver Chau, R.M.W., et al., Cloning of Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factor 1 (MNTF1) and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes, (abstract) , 19 Soc. For Neurosci. Part 1, 252 (1993) . 252 (1993) . Un extracto conteniendo el FMNT1 humano clonado mostró tener actividad biológica similar a la de la proteína FMNT1 “nativa” en que apoyaba el crecimiento in vitro de motoneuronas del asta anterior de rata.

Más recientemente, la Patente estadounidense US 6.309.877 divulgó una familia de factores neuronotróficos que poseen la capacidad de ejercer un efecto trófico sobre las motoneuronas. Los factores motoneurotróficos fueron aislados, las secuencias de ácido nucleico codificadoras de estos factores fueron clonadas y expresadas, y se pusieron a disposición tanto el ácido nucleico como secuencias polipéptidas. En concreto, las proteínas recombinantes FMNT1-T3 y FMNT1-T6, codificadas por materias insertadas de par de base 1443 y 972, respectivamente, fueron expresadas o bien como proteínas de fusión o como fragmentos purificados. Los factores aislados y los factores expresados, recombinantes, fueron aptos para inducir la viabilidad continua y la excrecencia neurita de motoneuronas. En consecuencia, estos factores han sido clasificados como “factores motoneuronotróficos” o “FMNTs”.

Los clones FMNT1-T6 divulgados en la patente estadounidense Nº 6.309.877 codifican un fragmento de aminoácido 33 de FMNT1. Una proteína recombinante que contiene esta secuencia reaccionó con un anticuerpo monoclónico a FMNT1, mantuvo la viabilidad motoneuronal, incrementó la excrecencia neurita, redujo la muerte celular/apoptosis y apoyó el crecimiento y “extensión” de motoneuronas en neuronas activas, gigantes con axones que contienen conos, de crecimiento extendido. En consecuencia, los siguientes estudios fueron implementados para determinar si un péptido que comprende una zona activa “mínima” puede ser sintetizado, lo que todavía retiene la actividad biológica de este fragmento de FMNT1.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se dirige a péptidos y composiciones nuevas – tal y como se definen en las reivindicaciones – que contengan partes de la molécula FMNT, que son útiles para modular la viabilidad y proliferación de células neuronales, poniendo a disposición, en consecuencia, péptidos neurotróficos que pueden ser inmediatamente sintetizados.

En concreto, la presente invención se dirige a un nuevo dominio proteico generalmente significativo para las acciones de factores motoneuronotróficos, que ha sido identificado y cartografiado en dos breves sub – secuencias superpuestas en la molécula FMNT1. Estos dominios proteicos no reconocidos hasta ahora, que se designan aquí como dominios “WMLSAFS” y “FSRYAR”, son suficientes para modular la viabilidad y proliferación de células neuronales. Además, las especies FMNT1... [Seguir leyendo]

1. Un análogo de péptido de factor motoneuronotrófico de una longitud de 6 a 32 amino ácidos, conteniendo dicho análogo de péptido una secuencia de amino ácido seleccionada del grupo consistente en:

(a) NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:2; y

(b) NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:3 En el que dicho análogo de péptido incrementa la viabilidad de neuronas motoras.

2. Un análogo de péptido de factor motoneuronotrófico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia amino ácida de dicho péptido es al menos en un 70 % idéntica a de nueve a 32 residuos consecutivos de amino ácido del NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:1.

3. Un análogo de péptido de factor motoneuronotrófico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia amino ácida de dicho péptido es al menos en un 80 % idéntica a de nueve a 32 residuos consecutivos de amino ácido del NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:1.

4. Un análogo de péptido de factor motoneuronotrófico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia amino ácida de dicho péptido es al menos en un 90 % idéntica a de nueve a 32 residuos consecutivos de amino ácido del NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:1.

5. Un análogo de péptido de factor motoneuronotrófico de acuerdo con la reivindicación 4, que contiene uno o más substitutivos conservativos de amino ácido a las de siete a 32 residuos consecutivos de amino ácido del NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:1.

6. Un análogo de péptido de factor motoneuronotrófico de acuerdo con la reivindicación 1, conteniendo dicho péptido un fragmento de seis a 32 residuos consecutivos de amino ácido del NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:1.

7. Un análogo de péptido de factor motoneuronotrófico de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado del grupo consistente en:

(a) NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:2,

(b) NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:3,

(c) NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:4,

(d) NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:5,

(e) NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:6, y

(f) NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:7.

8. Un conjugado que comprenda:

(a) Un péptido de factor motoneurotrófico de 6 a 32 amino ácidos de longitud que contenga una secuencia de amino ácido seleccionada del grupo consistente del NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:2 y del NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:3; y

(b) Una partícula sólida, proteína portadora o marcador enlazado al péptido de factor motoneuronotrófico.

9. Una proteína de fusión que comprenda:

(a) Un péptido de factor motoneurotrófico de 6 a 32 amino ácidos de longitud que contenga una secuencia de amino ácido seleccionada del grupo consistente del NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:2 y del NUMERO DE IDENTIFICACION SECUENCIAL:3

(b) Una proteína heteróloga fusionada al péptido de factor motoneuronotrófico.

10. Una composición que comprenda el análogo de péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador.

11. Una composición para la promoción selectiva de la viabilidad de neuronas motoras y la regeneración axiónica que comprenda una cantidad efectiva del análogo de péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador farmacológicamente aceptable.

12. Una composición para uso en la re – innervación de músculo objeto que comprenda una cantidad efectiva del análogo de péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador farmacológicamente aceptable.

13. Una composición para uso en el tratamiento de daños nerviosos periféricos que comprenda una cantidad efectiva del análogo de péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador farmacológicamente aceptable.

14. Una composición para uso en el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa que comprenda una cantidad efectiva del análogo de péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador farmacológicamente aceptable.

15. Una composición para uso en la curación de heridas que comprenda una cantidad efectiva del análogo de péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador farmacológicamente aceptable.

16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la cantidad efectiva es una cantidad suficiente para reducir la formación de tejido de cicatriz.

17. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la cantidad efectiva es una cantidad suficiente para reducir la proliferación o infiltración de células inflamatorias.

18. El uso de un análogo de péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para la promoción selectiva de la viabilidad de neuronas motoras y la regeneración axiónica.

19. El uso de un análogo de péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para la reducción de la apoptosis de motoneuronas dañadas y las células de Schwann asociadas en una zona de daño.

20. El uso de un análogo de péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para la inhibición del crecimiento, viabilidad o migración de células no neuronales seleccionadas del grupo consistente de fibroblastos, macrófagos y linfocitos en una zona de daño.

21. El uso de un análogo de péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del daño en la médula espinal.

22. El uso de un análogo de péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad degenerativa neuromuscular, siendo dicha enfermedad neurodegenerativa neuromuscular una enfermedad en la que los músculos asociados con las motoneuronas enfermas degeneran.

23. El uso de un análogo de péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para la protección de motoneuronas de la degeneración en una zona de daño nervioso periférico.

24. Uso de un análogo de péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para el alivio de la neuropatía periférica y del daño neuropático en una zona de daño neuropático.