Péptidos que se unen al receptor de eritropoyetina.

Un péptido de 17 a 40 residuos de aminoácidos de longitud y comprendiendo lasecuencia de aminoácidos:

LYACHX0GPITX1VCQPLR (SEQ ID NO: 1),

en la que X0 es un residuo seleccionado entre metionina (M) y homoserina metiléter (Hsm),y X1 es un residuo seleccionado entre triptófano (W), 1-naftilalanina (1-nal), y 2-naftilalanina (2-nal), donde dicho péptido se une a y activa el receptor de eritropoyetina(EPO-R).

PÉPTIDOS QUE SE UNEN AL RECEPTOR DE ERITROPOYETINA

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a compuestos de péptidos que son agonistas del receptor de la eritropoyetina (EPO-R) y usos de los mismos para tratar alteraciones asociadas a una producción de glóbulos rojos deficiente o insuficiente. También se proporcionan las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de péptidos de la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La eritropoyetina (EPO) es una hormona de glicoproteína de 165 aminoácidos, con un peso molecular de aproximadamente 34 kilodaltones (kD) y lugares de glicosilación preferidos en las posiciones de aminoácido 24, 38, 83, y 126. Se produce inicialmente como una proteína precursora con un péptido señal de 23 aminoácidos. La EPO puede producirse de tres formas: a, º, y asialo. Las formas a y º difieren ligeramente en sus componentes de carbohidratos, pero tienen la misma potencia, actividad biológica, y peso molecular. La forma asialo es una forma a o º con el carbohidrato terminal (ácido siálico) eliminado. Han sido presentadas secuencias de ADN que codifican la EPO [patente estadounidense nº 4.703.008 a Lin]. [0003] La EPO estimula la división mitótica y la diferenciación de las células precursoras de eritrocitos, y garantiza así la producción de eritrocitos. Se produce en el riñón cuando prevalecen condiciones hipóxicas. Durante la diferenciación de células precursoras de eritrocitos inducida por la EPO, se induce la síntesis de la globina; se estimula la síntesis del complejo hemo; y el número de receptores de ferritina aumenta. Estos cambios permiten a la célula tomar más hierro y sintetizar la hemoglobina funcional, que en los eritrocitos maduros se une al oxígeno. Por lo tanto, los eritrocitos y su hemoglobina juegan un papel crucial en el suministro de oxígeno al cuerpo. Estos cambios se inician mediante la interacción de la EPO con un receptor apropiado en la superficie celular de las células precursoras de eritrocitos [Véase, p.ej., Graber y Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29.51-66]. [0004] La EPO está presente en concentraciones muy pequeñas en el plasma cuando el cuerpo se encuentra en un estado sano en el que los tejidos reciben una oxigenación suficiente del número existente de eritrocitos. Esta concentración baja normal es suficiente para estimular la sustitución de glóbulos rojos que se pierden normalmente por el envejecimiento. [0005] La cantidad de EPO en la circulación aumenta en condiciones de hipoxia cuando se reduce el transporte de oxígeno por las células sanguíneas en la circulación. La hipoxia puede causarse, por ejemplo, por una pérdida de sangre sustancial a través de hemorragia, destrucción de glóbulos rojos por una sobreexposición a la radiación, reducción en la entrada de oxígeno debido a una elevada altitud o inconsciencia prolongada, o diversas formas de anemia. En respuesta a dicho estrés hipóxico, los elevados niveles de EPO aumentan la producción de glóbulos rojos estimulando la proliferación de células progenitoras eritroides. Cuando el número de glóbulos rojos en circulación es mayor que el necesario para las necesidades de oxígeno de los tejidos normales, se disminuyen los niveles de EPO en circulación. [0006] Puesto que la EPO es esencial en el proceso de formación de glóbulos rojos, esta hormona tiene aplicaciones potencialmente útiles en el diagnóstico y el tratamiento de trastornos sanguíneos caracterizados por una producción de glóbulos rojos baja o deficiente. Estudios recientes han proporcionado una base para la proyección de la eficacia de la terapia de EPO para una variedad de estados patológicos, trastornos, y estados de irregularidad hematológica, incluyendo: beta-talasemia [véase, Vedovato, et al. (1984) Acta. Haematol. 71:211-213]; fibrosis cística [véase, Vichinsky, et al. (1984) J. Pediatric 105:15-21]; trastornos del embarazo y menstruales [véase, Cotes, et al. (193) Brit.

J. Ostet. Gyneacol. 90:304-311]; anemia temprana del prematuro [véase, Haga, et al. (1983) Acta Pediatr. Scand. 72; 827-831]; lesión de médula espinal [véase, Claus-Walker, et al. (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65:370-374]; vuelos espaciales [véase, Dunn, et al. (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52:178-182]; pérdida de sangre aguda [véase, Miller, et al. (1982) Brit. J. Haematol. 52:545-590]; envejecimiento [véase, Udupa, et al. (1984) J. Lab. Clin. Med. 103:574-580 y 581-588 y Lipschitz, et al. (1983) Blood 63:502-509]; diversos estados de enfermedad neoplásica acompañados por eritropoyesis anormal [véase, Dainiak, et al. (1983) Cancer 5:1101-1106 y Schwartz, et al. (1983) Otolar y ngol. 109:269272]; e insuficiencia renal [véase, Eschbach. et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316:73-78]. [0007] La EPO homogénea purificada ha sido caracterizada [patente estadounidense nº

4.677.195 a Hewick]. Una secuencia de ADN que codifica la EPO fue purificada, clonada y expresada para producir polipéptidos recombinantes con las mismas propiedades bioquímicas e inmunológicas que la EPO natural. También se ha producido una molécula de EPO recombinante con oligosacáridos idénticos a aquellos en la EPO natural [véase, Sasaki, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:12059-12076]. [0008] El efecto biológico de la EPO parece estar mediado, en parte, a través de la interacción con un receptor unido a la membrana celular. Estudios iniciales, que utilizan células eritroides inmaduras aisladas del bazo de ratón, sugirieron que las proteínas de la superficie celular de unión a la EPO comprenden dos polipéptidos que tienen pesos moleculares aproximados de 85.000 daltons y 100.000 daltons, respectivamente [Sawyer, et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3690-3694]. El número de sitios de unión a la EPO se calculó en una media de 800 a 1000 por superficie celular. De estos sitios de unión, aproximadamente 300 se unieron a EPO con una Kd de aproximadamente 90 pM (picomolar) , mientras que el resto se unió a la EPO con una afinidad reducida de aproximadamente 570 pM [Sawyer, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:5554-5562]. Un estudio independiente sugirió que los eritroblastos esplénicos sensibles a la EPO, preparados a partir de ratones a los que se inyectó la cepa anémica (FVA) del virus de la leucemia de Friend, poseen un total de aproximadamente 400 sitios de unión de alta y baja afinidad a EPO con valores de Kd de aproximadamente 100 pM y 800 pM, respectivamente [Landschulz, et al. (1989) Blood 73:1476-1486]. [0009] El trabajo posterior indicó que las dos formas del receptor de EPO (EPO-R) son codificadas por un solo gen. Este gen ha sido clonado [véase, p.ej., Jones, et al. (1990) Blood 76, 31-35; Noguchi, et al. (1991) Blood 78:2548-2556; Maouche, et al. (1991) Blood 78:2557-2563]. Por ejemplo, las secuencias de ADN y secuencias de péptidos codificada para las proteínas de EPO-R humana y murina se describen en la Pub. PCT Nº WO 90/08822 de D'Andrea, et al. Los modelos actuales sugieren que la unión de EPO a EPO-R resulta en la dimerización y activación de dos moléculas de EPO-R, que resulta en las fases posteriores de transducción de señal [véase, p.ej., Watowich, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2140-2144]. [0010] La disponibilidad de genes clonados para EPO-R facilita la búsqueda de agonistas y antagonistas de este importante receptor. La disponibilidad de la proteína receptora recombinante permite el estudio de la interacción receptor/ligando en una variedad de sistemas de generación de diversidad de péptidos aleatorios o semialeatorios. Estos sistemas incluyen el sistema de "péptidos en plásmidos" [descrito en la patente estadounidense nº 6.270.170]; el sistema de "péptidos en el fago" [descrito en la patente estadounidense nº 5.432.018 y Cwirla, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:63786382]; el sistema de "biblioteca codificada de síntesis" (ESL, en inglés) [descrito en la solicitud de patente estadounidense nº de serie 946.239 presentada en Sep. 16, 1992]; y el sistema de "síntesis de polímero inmovilizado a muy gran escala" [descrito en la patente estadounidense nº 5.143.854; Pub. PCT nº 90/15070; Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773; Dower and Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180; y patente estadounidense nº 5.424.186]. [0011] Se han identificado y descrito los péptidos que interactúan al menos en cierta medida con el EPO-R, por ejemplo en las patentes estadounidenses nº 5.773.569,

5.830.851 y 5.986.047 de Wrighton, et al.; Pub. PCT nº WO 96/40749 de Wrighton, et al.; patente estadounidense nº 5.767.078 y Pub. PCT nº 96/40772 de Johnson y Zivin; Pub. PCT nº WO 01/38342 de Balu; y WO 01/91780 de Smith-Swintosky, et al. En especial, se ha identificado un grupo de péptidos que contienen un motivo peptídico, cuyos miembros se unen al EPO-R y estimulan... [Seguir leyendo]

1. Un péptido de 17 a 40 residuos de aminoácidos de longitud y comprendiendo la secuencia de aminoácidos: LYACHX0GPITX1VCQPLR (SEQ ID NO: 1) ,

en la que X0 es un residuo seleccionado entre metionina (M) y homoserina metiléter (Hsm) , y X1 es un residuo seleccionado entre triptófano (W) , 1-naftilalanina (1-nal) , y 2naftilalanina (2-nal) , donde dicho péptido se une a y activa el receptor de eritropoyetina (EPO-R) .

2. Un péptido según la reivindicación 1, en el que el extremo N-terminal de dicho péptido está acetilado.

3. Un péptido según la reivindicación 1 o reivindicación 2, comprendiendo dicho péptido una secuencia de aminoácidos elegida entre:

4. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en el que el péptido es un monómero.

5. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, comprendiendo además uno o más polímeros solubles en agua unidos covalentemente al péptido.

6. Un péptido según la reivindicación 5, en el que el polímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG) .

7. Un péptido según la reivindicación 6, en el que dicho PEG comprende una molécula lineal no ramificada que tiene un peso molecular de 500 a 60.000 Daltons.

8. Un péptido según la reivindicación 7, en el que el PEG tiene un peso molecular de menos de 20.000 Daltons.

9. Un péptido según la reivindicación 7, en el que el PEG tiene un peso molecular de

LYACHMGPITWVCQPLR (SEQ ID NO: 2) ;

LYACHMGPIT (1-nal) VCQPLR (SEQ ID NO: 3) ;

LYACHMGPIT (2-nal) VCQPLR (SEQ ID NO: 4) ;

GGLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO: 5) ;

GGLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 6) ;

GGLYACHMGPIT (2-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 7) ;

(AcG) GLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO: 8) ;

(AcG) GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 9) ;

(AcG) GLYACHMGPIT (2-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 10) ;

GGLYACHMGPITWVCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 11) ;

GGLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 12) ;

GGLYACHMGPIT (2-nal) VCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 13) ;

(AcG) GLYACHMGPITWVCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 14) ;

(AcG) GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 15) ;

(AcG) GLYACHMGPIT (2-nal) VCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 16) ;

LYACH (Hsm) GPITWVCQPLR (SEQ ID NO: 17) ;

LYACH (Hsm) GPIT (1-nal) VCQPLR (SEQ ID NO: 18) ;

LYACH (Hsm) GPIT (2-nal) VCQPLR (SEQ ID NO: 19) ;

GGLYACH (Hsm) GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO: 20) ;

GGLYACH (Hsm) GPIT (1-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 21) ;

GGLYACH (Hsm) GPIT (2-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 22) ;

(AcG) GLYACH (Hsm) GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO: 23) ;

(AcG) GLYACH (Hsm) GPIT (1-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 24) ;

(AcG) GLYACH (Hsm) GPIT (2-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 25) ;

GGLYACH (Hsm) GPITWVCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 26) ;

GGLYACH (Hsm) GPIT (1-nal) VCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 27) ;

GGLYACH (Hsm) GPIT (2-nal) VCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 28) ;

(AcG) GLYACH (Hsm) GPITWVCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 29) ;

(AcG) GLYACH (Hsm) GPIT (1-nal) VCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 30) ; y

(AcG) GLYACH (Hsm) GPIT (2-nal) VCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 31) .

20.000 a 60.000 Daltons.

10. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6-7 y 9, en el que el PEG tiene un peso molecular de 20.000 a 40.000 Daltons.

11. Un péptido según la reivindicación 7, en el que dos fracciones de PEG están unidas de forma covalente al péptido, comprendiendo cada uno de dichos PEG una molécula lineal no ramificada.

12. Un péptido según la reivindicación 11, en el que cada uno de dichos PEG tiene un peso molecular de 20.000 a 30.000 Daltons.

13. Un dímero peptídico que comprende dos monómeros, siendo los dos de dichos monómeros un péptido según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 y de la 5 a la

12.

14. Un dímero peptídico según la reivindicación 13, en el que el péptido es un homodímero.

15. Un dímero peptídico según la reivindicación 13, que comprende:

(a) una primera cadena peptídica;

(b) una segunda cadena peptídica; y

(c) una fracción de enlace que conecta dicha primera y segunda cadena peptídica, donde tanto dicha primera cadena peptídica como dicha segunda cadena peptídica son péptidos según la reivindicación 1.

16. Un dímero peptídico según la reivindicación 15, en el que al menos una de dichas primera cadena peptídica y segunda cadena peptídica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:

LYACHMGPITWVCQPLR (SEQ ID NO: 2) ;

LYACHMGPIT (1-nal) VCQPLR (SEQ ID NO: 3) ;

LYACHMGPIT (2-nal) VCQPLR (SEQ ID NO: 4) ;

GGLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO: 5) ;

GGLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 6) ;

GGLYACHMGPIT (2-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 7) ;

(AcG) GLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO: 8) ;

(AcG) GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 9) ;

(AcG) GLYACHMGPIT (2-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 10) ;

GGLYACHMGPITWVCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 11) ;

GGLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 12) ;

GGLYACHMGPIT (2-nal) VCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 13) ;

(AcG) GLYACHMGPITWVCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 14) ;

(AcG) GLYACHMGPIT (1-nal) VCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 15) ;

(AcG) GLYACHMGPIT (2-nal) VCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 16) ;

LYACH (Hsm) GPITWVCQPLR (SEQ ID NO: 17) ;

LYACH (Hsm) GPIT (1-nal) VCQPLR (SEQ ID NO: 18) ;

LYACH (Hsm) GPIT (2-nal) VCQPLR (SEQ ID NO: 19) ;

GGLYACH (Hsm) GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO: 20) ;

GGLYACH (Hsm) GPIT (1-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 21) ;

GGLYACH (Hsm) GPIT (2-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 22) ;

(AcG) GLYACH (Hsm) GPITWVCQPLRG (SEQ ID NO: 23) ;

(AcG) GLYACH (Hsm) GPIT (1-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 24) ;

(AcG) GLYACH (Hsm) GPIT (2-nal) VCQPLRG (SEQ ID NO: 25) ;

GGLYACH (Hsm) GPITWVCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 26) ;

GGLYACH (Hsm) GPTT (1-nal) VCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 27) ;

GGLYACH (Hsm) GPIT (2-nal) VCQPLR (MeG) (SEQ ID NO: 28) ;

(AcG) GLYACH (Hsm) GPITWVCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 29) ;

(AcG) GLYACH (Hsm) GPIT (1-nal) VCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 30) ; y

(AcG) GLYACH (Hsm) GPIT (2-nal) VCQPLRG (MeG) (SEQ ID NO: 31) .

17. Un dímero peptídico según la reivindicación 15, en el que la fracción de enlace comprende la fórmula:

-NH-R3-NHdonde R3 es un alquileno C1-6.

18. Un dímero peptídico según la reivindicación 17, en el que la fracción de enlace es un residuo de lisina.

19. Un dímero peptídico según la reivindicación 15, en el que la fracción de enlace comprende la fórmula:

- CO- (CH2) n-X- (CH2) m-COdonde n es un entero de 0 a 10, m es un entero de 1 a 10, X se elige entre O, S, N (CH2) pNR1, NCO (CH2) pNR1, y CHNR1, R1 se elige entre H, Boc y Cbz, y p es un entero de 1 a 10.

20. Un dímero peptídico según la reivindicación 19, en el que n y m son cada uno 1, X es NCO (CH2) pNR1, p es 2, y R1 es H.

21. Un dímero peptídico según la reivindicación 15, que comprende además un polímero soluble en agua.

22. Un dímero peptídico según la reivindicación 21, en el que el polímero soluble en agua está unido de forma covalente a la fracción de enlace.

23. Un dímero peptídico según la reivindicación 15, que comprende además una fracción espaciadora.

24. Un dímero peptídico según la reivindicación 23, en el que la fracción espaciadora

comprende la fórmula: -NH- (CH2) a-[O- (CH2) ]V-O0- (CH2) £-Y

donde a, , y £ son todos enteros cuyos valores se eligen de forma independiente de 1 a 6, 0 es 0 ó 1, V es un entero seleccionado de 0 a 10, e Y se selecciona de NH o CO, siempre que sea 2 cuando V sea mayor de 1.

25. Un dímero peptídico según la reivindicación 24 en el que cada uno de a, , y £ es 2, cada uno de V y 0 es 1, e Y es NH.

26. Un dímero peptídico según la reivindicación 23, que comprende además uno o más polímeros solubles en agua.

27. Un dímero peptídico según la reivindicación 26, en el que el polímero soluble en agua está unido de forma covalente a la fracción espaciadora.

28. Un dímero peptídico según la reivindicación 21 ó 26, en el que el polímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG) .

29. Un dímero peptídico según la reivindicación 28, en el que el PEG es un PEG lineal no ramificado que tiene un peso molecular de 500 a 60.000 Daltons.

30. Un dímero peptídico según la reivindicación 28 ó 29, en el que el PEG tiene un peso molecular de 500 a menos de 20.000 Daltons.

31. Un dímero peptídico según la reivindicación 28 ó 29, en el que el PEG tiene un peso molecular de 20.000 a 60.000 Daltons.

32. Un dímero peptídico según la reivindicación 28, 29 ó 31, en el que el PEG tiene un peso molecular de 20.000 a 40.000 Daltons.

33. Un dímero peptídico según la reivindicación 28, en el que dos fracciones de PEG están unidas de forma covalente al péptido, comprendiendo cada uno de dichos PEG una molécula lineal no ramificada.

34. Un dímero peptídico según la reivindicación 33, en el que cada uno de dichos PEG tiene un peso molecular de 20.000 a 30.000 Daltons.

35. Un péptido o dímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 34 para su uso en el tratamiento de un trastorno caracterizado por una deficiencia de eritropoyetina o por una población de glóbulos rojos baja o deficiente.

36. Un péptido o dímero peptídico para su uso según la reivindicación 35, en el que el trastorno se selecciona entre el grupo compuesto por: diálisis o insuficiencia renal en fase terminal; anemia asociada al SIDA; enfermedades autoinmunes o una malignidad; beta talasemia; fibrosis cística; anemia de la premadurez temprana; anemia asociada con enfermedades inflamatorias crónicas; lesión de la médula espinal; pérdida de sangre aguda; envejecimiento; y estados de enfermedad neoplásicos acompañados por eritropoyesis anormal.

37. Una composición farmacéutica que comprende:

(i) un péptido o dímero peptídico según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 34; y

(ii) un portador farmacéuticamente aceptable.