OBTENCIÓN DE PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA EN TEJIDOS TUMORALES BIOPSIADOS.

Método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin la recidiva de cáncer de mama,

tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende determinar el nivel de expresión del transcrito de ARN de CCNB1, en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida de dicho paciente, normalizado frente al nivel de expresión de un conjunto de referencia de transcritos de ARN, en el que la sobreexpresión de dicho CCNB1 indica una disminución de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama

Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados La presente invención se refiere a la obtención del perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados. En particular, la presente invención se refiere a métodos sensibles para medir los niveles de ARNm en tejidos tumorales biopsiados, incluyendo material de biopsia incrustado en parafina archivado. Además, la invención proporciona un conjunto de genes cuya expresión es importante en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama.

Los oncólogos disponen de varias opciones de tratamiento, incluyendo diferentes combinaciones de fármacos quimioterápicos que se caracterizan como “tratamiento de referencia”, y varios fármacos que no portan un declarado en la etiqueta para un cáncer particular, pero para los que hay pruebas de eficacia en ese cáncer. La mejor probabilidad de un buen desenlace del tratamiento requiere que los pacientes se asignen al tratamiento contra el cáncer disponible óptimo, y que esta asignación se haga lo más rápidamente como sea posible tras el diagnóstico.

Actualmente, las pruebas de diagnóstico usadas en la práctica clínica son de analito único, y por tanto no capturan el valor potencial de conocer las relaciones entre docenas de diferentes marcadores. Además, las pruebas de diagnóstico frecuentemente son no cuantitativas, basándose en inmunohistoquímica. Este método produce a menudo diferentes resultados en diferentes laboratorios, en parte porque los reactivos no están normalizados, y en parte porque las interpretaciones son subjetivas y no pueden cuantificarse fácilmente. Las pruebas basadas en ARN no se han usado a menudo debido al problema de la degradación del ARN a lo largo del tiempo y el hecho de que es difícil obtener muestras de tejido recientes de los pacientes para el análisis. Está más fácilmente disponible tejido incrustado en parafina fijado y se han establecido métodos para detectar ARN en tejido fijado. Sin embargo, estos métodos normalmente no permiten el estudio de grandes números de genes (ADN o ARN) a partir de pequeñas cantidades de material. Por tanto, pocas veces se ha usado tejido fijado de manera tradicional para otras cosas que para la detección inmunohistoquímica de proteínas.

Recientemente, varios grupos han publicado estudios referentes a la clasificación de diversos tipos de cáncer mediante análisis de la expresión génica con microalineamientos (véanse, por ejemplo Golub et al., Science 286:531-537 (1999) ; Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:13790-13795 (2001) ; Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (supl. 1) :S316-S322 (2001) ; Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15149-15154 (2001) ) . También se han notificado ciertas clasificaciones de cánceres de mama humanos basándose en los patrones de expresión génica (Martin et al., Cancer Res. 60:2232-2238 (2000) ; West et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:11462-11467 (2001) ; Sorlie et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:10869-10874 (2001) ; Yan et al., Cancer Res. 61:8375-8380 (2001) ) . Sin embargo, estos estudios se centran en su mayor parte en mejorar y refinar la clasificación ya establecida de diversos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, y generalmente no proporcionan nuevas percepciones en las relaciones de los genes expresados de manera diferencial, y no vinculan los hallazgos a estrategias de tratamiento con el fin de mejorar el desenlace clínico de la terapia contra el cáncer.

Winters et al. (2001) European Journal of Cancer 37, 2405-12 dan a conocer la localización subcelular de la proteína ciclina B, Cdc2 y p21WAF1/CIP1 mediante inmunohistoquímica en cáncer de mama y su asociación con el pronóstico.

El documento WO 06/60076 da a conocer composiciones y métodos para la terapia y el diagnóstico de cáncer, tal como cáncer de mama. Las composiciones pueden comprender una o más proteínas de tumor mamario, partes inmunogénicas de las mismas o polinucleótidos que codifican para tales partes. Alternativamente, una composición terapéutica puede comprender una célula presentadora de antígenos que expresa una proteína de tumor mamario, o una célula T que es específica para células que expresan una proteína de este tipo. Tales composiciones pueden usarse, por ejemplo, para la prevención y el tratamiento de enfermedades tales como cáncer de mama. También se dan a conocer métodos de diagnóstico basados en la detección de una proteína de tumor mamario, o ARNm que codifica para una proteína de este tipo, en una muestra.

Yu et al. (2001) Molecular Immunology 38, 981-7 dan a conocer el reconocimiento inmunitario de ciclina B1 como antígeno tumoral que resulta de su sobreexpresión en tumores humanos provocados por p53 no funcional.

Aunque la moderna bioquímica y biología molecular han revelado más de 100 genes cuyas actividades influyen en el comportamiento de células tumorales, el estado de su diferenciación y su sensibilidad o resistencia a ciertos fármacos terapéuticos, con unas pocas excepciones, el estado de estos genes no se ha aprovechado para el fin de tomar decisiones clínicas de manera rutinaria sobre los tratamientos farmacológicos. Una notable excepción es el uso de la expresión de la proteína de receptor de estrógenos (RE) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes a tratamiento con fármacos antiestrógenos, tales como tamoxifeno. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (Her2) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes con el fármaco antagonista de Her2 Herceptin® (Genentech, Inc., South San Francisco, CA) .

A pesar de los recientes avances, el desafío del tratamiento contra el cáncer sigue siendo dirigir regímenes de tratamiento específicos a tipos de tumores patogénicamente distintos, y en última instancia personalizar el tratamiento tumoral con el fin de maximizar el desenlace. Por tanto, existe una necesidad de pruebas que proporcionan simultáneamente información predictiva sobre las respuestas de los pacientes a la variedad de opciones de tratamiento. Esto es particularmente cierto para cáncer de mama, cuya biología se entiende mal. Está claro que la clasificación del cáncer de mama en unos cuantos subgrupos, tales como el subgrupo ErbB2+ y los subgrupos caracterizados por expresión génica de baja a ausente del receptor de estrógenos (RE) y unos cuantos factores de transcripción adicionales (Perou et al., Nature 406:747-752 (2000) ) no se refleja en la heterogeneidad celular y molecular del cáncer de mama, y no permite el diseño de estrategias de tratamiento que maximicen la respuesta del paciente Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método tal como se especifica en la reivindicación 1.

La presente memoria descriptiva da a conocer (1) métodos sensibles para medir los niveles de ARNm en el tejido tumoral biopsiado, (2) un conjunto de aproximadamente 190 genes, cuya expresión es importante en el diagnóstico de cáncer de mama, y (3) la significación de la expresión anómalamente baja o alta para los genes identificados e incluidos en el conjunto de genes, a través de activación o alteración de las rutas reguladoras bioquímicas que influyen en la respuesta del paciente a fármacos particulares usados o potencialmente útiles en el tratamiento del cáncer de mama. Estos resultados permiten la evaluación de pruebas genómicas de la eficacia de más de una docena de fármacos relevantes.

La presente invención adapta el uso de material de biopsia incrustado en parafina archivado para el ensayo de todos los marcadores en el conjunto, y por tanto es compatible con el tipo de material de biopsia más ampliamente disponible. La memoria descriptiva da a conocer un método eficaz para la extracción de ARN a partir de tejidos fijados, incrustados en parafina, que reduce el coste del proceso de producción en masa para la adquisición de esta información sin sacrificar la calidad del análisis. Además, la memoria descriptiva da a conocer un método novedoso sumamente eficaz para amplificar el número de copias del ARNm, lo que permite aumentar la sensibilidad del ensayo y la capacidad de monitorizar la expresión de grandes números de genes diferentes dada las cantidades limitadas de material de biopsia. La memoria descriptiva también captura la significación predictiva de las relaciones entre las expresiones de ciertos marcadores en el conjunto de marcadores del cáncer de mama. Finalmente, para cada miembro del conjunto de genes, la memoria descriptiva especifica las secuencias de oligonucleótidos que van a usarse en la prueba.

En todos los aspectos previos,... [Seguir leyendo]

1. Método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin la recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende determinar el nivel de expresión del transcrito de ARN de CCNB1, en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida de dicho paciente, normalizado frente al nivel de expresión de un conjunto de referencia de transcritos de ARN, en el que la sobreexpresión de dicho CCNB1 indica una disminución de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además determinar el nivel de expresión de uno o más transcritos de ARN de pronóstico o sus productos en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida de dicho paciente, normalizado frente al nivel de expresión de todos los transcritos de ARN o sus productos en dicha muestra de tejido de cáncer de mama, o de un conjunto de referencia de transcritos de ARN o sus productos, en el que el uno o más transcritos de pronóstico son los transcritos de genes seleccionados del grupo que consiste en: Bcl2, FOXM1, PRAME, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, CA9, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, GSTM3, RPS6KB1, Src, Chk1, ID1, EstR1, p27, XIAP, Chk2, CDC25B, IGF1R, AK055699, P13KC2A, TGFB3, BAGI1, CYP3A4, EpCAM, VEGFC, Ps2, hENT1, WISP1, BRCA2, EGFR, TK1, VDR, Pent1, EPHX1, IF1A, CDH1, HIF1e, IGFBP3, CTSB y Her2;

en el que la sobreexpresión de uno o más de FOXM1, PRAME, STK15, Ki-67, CA9, NME1, SURV, TFRC, YB-1, RPS6KB1, Src, Chk1, CCNB1, Chk2, CDC25B, CYP3A4, EpCAM, VEGFC, hENT1, BRCA2, EFGR, TK1, VDR, EPHX1, IF1A, CDH1, HIF1e, IGFBP3, CTSB, Her2 y Pent1 indica una disminución de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama, y la sobreexpresión de uno o más de Bcl2, CEGP1, GSTM1, PR, BBC3, GATA3, DPYD, GSTM3, ID1, EstR1, p27, XIAP, IGF1R, AK055699, P13KC2A, TGFB3, BAGI1, Ps2, WISP1, HNF3A, NFKBp65 y DIABLO indica un aumento de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama;

particularmente en el que se determina el nivel de expresión de al menos 2, más particularmente al menos 5, más particularmente al menos 10, más particularmente al menos 15 transcritos de pronóstico o sus productos de expresión.

3. Método según la reivindicación 1, que comprende además determinar los niveles de expresión de los transcritos de ARN de los siguientes genes: PRAME, VEGFC, HIF1A, hENT1, GCLC, TIMP2, ID1, p27 y upa, o sus productos de expresión, en el que el cáncer de mama es cáncer de mama invasivo positivo para receptor de estrógenos (RE) .

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho ARN se aísla de una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado de dicho paciente.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que los niveles de expresión de los transcritos de ARN se cuantifican mediante RT-PCR.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que los niveles de expresión de los transcritos de ARN se cuantifican mediante un alineamiento.