PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE LISIS DE MUESTRAS MICROBIANAS.

Procedimiento de obtención de ácidos nucleicos mediante lisis de muestras microbianas Campo de la invención La invención se refiere a procedimientos simples y rápidos para el aislamiento de ácidos nucleicos partiendo de células microbianas, particularmente células bacterianas y fúngicas, usando un procedimiento de lisis universal. Antecedentes de la invención Con el advenimiento de la biología molecular, un número creciente de procedimientos de diagnóstico se basan en la detección de ácidos nucleicos. Las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos representan herramientas útiles en la biología molecular. Desde el descubrimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se han descrito varios protocolos para el aislamiento de ácidos nucleicos que son adecuados para la detección e identificación de microorganismos. Sin embargo, la mayoría de estos protocolos requieren mucho tiempo y, frecuentemente, requieren el uso de productos químicos tóxicos. Además, los protocolos necesitan ser adaptados para cada tipo de microbio; un protocolo de lisis para hongos puede no ser adecuado para bacterias gram-negativas, o parásitos, o esporas bacterianas, etc. Además, estos protocolos requieren numerosas etapas, incrementando el riesgo de contaminación de muestra a muestra o por traspaso. Además, en muchos casos, la identidad de los microorganismos presentes en una muestra será desconocida, haciendo imposible determinar qué protocolo específico sería apropiado, siendo necesarios múltiples ensayos para una única muestra. Se han descrito muchos procedimientos para alterar células microbianas, previamente a la liberación de ácidos nucleicos (véase, Hugues et al. Methods in Microbiology, 1971, vol. 5B, Academic Press, Nueva York, para una revisión de estos procedimientos). El procedimiento seleccionado dependerá de su capacidad para procesar muestras de un cierto tamaño o su capacidad para procesar múltiples muestras en un periodo de tiempo razonable, mientras los ácidos nucleicos retienen su integridad. Los procedimientos físicos clásicos de rotura de células incluyen la desintegración celular mecánica (trituración y molido, molido en húmedo, ultrasonidos, cizalla hidráulica, presión por congelación), cizalla líquida o hidrodinámica (prensa francesa, prensa Chaikoff, homogeneizadores, molinos húmedos, molinos de vibración, filtros, desintegración por ultrasonidos) y cizalla sólida (molido, prensa Hugues). Los procedimientos químicos y biológicos de desintegración de células están dirigidos, en su mayoría, a modificar la pared celular o membrana citoplasmática, o ambas, de manera que las células tengan fugas o revienten debido a los efectos de la presión de turgencia. Los procedimientos incluyen ósmosis, secado y extracción, autolisis, inhibición de síntesis de la pared celular, ataque enzimático sobre paredes celulares, bacteriófagos y otros factores líticos y radiación ionizante. Muchos de los procedimientos de aislamiento de plásmidos o ADN genómico de bacterias usan lisozima u otras enzimas líticas (tales como mutanolisina o lisostafina) para conseguir la lisis enzimática de bacterias, para recuperar el ácido nucleico del lisado de células. De manera similar, muchos de los procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos de levadura (ADN genómico o plásmido de ADN) implican el uso de fuerza mecánica de cizalladura o digestión enzimática con enzimas tales como liticasa, zimolasa o quitinasa, para romper la pared celular de la levadura para permitir el aislamiento de los ácidos nucleicos. Se conoce que la lisozima puede romper efectivamente la pared celular bacteriana, escindiendo los enlaces ß-1,4-glicosídicos entre N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico en peptidoglicano, el componente estructural principal de la pared celular bacteriana. También está bien documentado que la liticasa puede degradar efectivamente la pared celular de las levaduras, principalmente a través de la actividad ß-1,3glucansa. Se ha demostrado que muchas de estas enzimas hidrolíticas tienen una actividad óptima en la presencia de iones metálicos divalentes, tales como Mg ++ , Ca ++ , etc. Está bien documentado que la actividad liticasa requiere un agente reductor, tal como ß-mercaptoetanol o DTT, para lisar efectivamente la pared celular de las levaduras. EDTA es un quelante de metales bien conocido, que es muy efectivo en el debilitamiento de la membrana celular externa de la bacteria, mediante la quelación de Mg ++ y Ca ++ , que son elementos esenciales que mantienen la estructura de las membranas enlazando LPS (lipopolisacárido) y proteínas entre sí. El documento WO 03/097831 divulga un procedimiento de lisis de levadura en el que las células son puestas en contacto con 0,1 M EDTA, 14 mM mercaptoetanol y 100 U liticasa. Hay una serie de kits disponibles en el mercado para el aislamiento o la detección de ácidos nucleicos, partiendo de varias fuentes celulares o virales. Típicamente, una primera etapa en cualquier procedimiento de aislamiento o de detección de ácido nucleico de una célula microbiana, implica la ruptura (lisis) de la pared celular y las membranas, para permitir que el contenido celular (incluyendo el contenido nuclear, si está presente) sea liberado al medio. Esta lisis celular puede conseguirse usando enzimas de lisis de los tipos descritos anteriormente. Debido a los diferentes requisitos de las enzimas de lisis usadas, la mayoría de los kits disponibles comercialmente están diseñados específicamente para aislar ácido nucleico de bacterias o levadura. Aunque hay algunos kits disponibles, que están diseñados para su uso con células de bacterias y levadura, estos emplean, generalmente, procedimientos mecánicos de rotura (por ejemplo, molido o agitación vorticial con perlas de vidrio) y/o el uso de solventes orgánicos para la 2 E05804047 15-11-2011   extracción o la precipitación y, por lo tanto, no son adecuados para la automatización. Sigue existiendo la necesidad de un procedimiento simple, rápido y ampliamente aplicable y automatizable para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de una variedad de microorganismos. Dicho procedimiento requiere un procedimiento de lisis que pueda ser aplicado a cualquier microorganismo presente en una muestra. Resumen de la invención La presente invención se refiere a procedimientos de rotura simple y rápida de células microbianas, para permitir la liberación de los ácidos nucleicos microbianos en una suspensión o muestra líquida. Los procedimientos de la invención pueden ser aplicados a muchos tipos diferentes de microorganismos, incluyendo diversas especies bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas), especies de hongos y virus, así como mezclas de estos microorganismos. El procedimiento es llevado a cabo con un mínimo de manipulación y, en una realización preferente, puede ser realizado en un único recipiente de reacción. El procedimiento no requiere una manipulación por separado para los diferentes tipos de microorganismos. El procedimiento de lisis de la invención es particularmente útil en un procedimiento para determinar la presencia de contaminación microbiana de una muestra, particularmente una muestra biológica (por ejemplo, sangre, plaquetas, concentrados de hematíes, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, fluidos de tejidos, los líquidos intersticiales, saliva, frotis vaginales, dentales, uterinos o rectales, lavado, esputo, biopsias de órganos o tejidos). Otros tipos de muestras son igualmente adecuados para su uso en el procedimiento de lisis, con la condición de se conozca o se sospeche que la muestra contiene microorganismos y que pueda ser preparada como una muestra líquida o suspensión (por ejemplo, muestras de agua de una planta de tratamiento de agua, soluciones o suspensiones farmacéuticas, frotis de superficies inertes o alimentos procesados, tales como leche, zumos de frutas y otras bebidas, carnes, etc.) El procedimiento de la invención, según se define en las reivindicaciones, utiliza una mezcla de enzimas y una alta concentración de un agente quelante para conseguir la ruptura celular de cualquier tipo de microorganismo. No se necesitan detergentes, agentes estabilizadores o agentes reductores para conseguir la ruptura de las células microbianas y permitir la liberación de los ácidos nucleicos, aunque dichos componentes pueden ser añadidos. En realizaciones adicionales, el procedimiento incluye el tratamiento de la muestra de células microbianas lisadas con una proteasa, para reducir la cantidad de proteína en la muestra de células microbianas lisadas y para facilitar el aislamiento de los ácidos nucleicos liberados. El ácido nucleico liberado puede ser aislado adicionalmente mediante cualquier técnica conveniente. Una técnica particularmente preferente usa un agente caotrópico,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de ruptura de células microbianas para permitir la liberación de ácido nucleico desde las células microbianas presentes en una muestra, que comprende: proporcionar una muestra que contiene o se sospecha que contiene células microbianas, en la que la muestra es una muestra líquida o suspensión, producir una composición de lisis de la muestra (1) añadiendo un agente quelante a la muestra hasta una concentración final de entre 0,3 M, y 0,5 M, (2) añadiendo a la muestra una mezcla de enzimas de lisis, e incubar la muestra durante un tiempo y a una temperatura suficientes para producir una muestra de células microbianas lisadas y permitir, de esta manera, la liberación de los ácidos nucleicos microbianos. 2. Procedimiento de ruptura de células microbianas según la reivindicación 1, en el que dicho agente quelante es seleccionado de entre el grupo que consiste en EDTA y EGTA y sus sales. 3 Procedimiento de ruptura de células microbianas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha mezcla de enzimas de lisis consiste, esencialmente, en al menos una enzima seleccionada de entre el grupo que consiste en lisozima, lisostafina y mutanolisina, y al menos una enzima seleccionada de entre el grupo que consiste en liticasa y zimolasa. 4. Procedimiento de ruptura de células microbianas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha mezcla de enzimas de lisis consiste esencialmente en al menos una enzima seleccionada de entre el grupo que consiste en lisozima, liostafina y mutanolisina, y al menos una enzima seleccionada de entre el grupo que consiste en liticasa y zimolasa. 5. Procedimiento de ruptura de células microbianas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha incubación es de entre aproximadamente 25ºC y aproximadamente 37ºC, durante entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 60 minutos. 6. Procedimiento de ruptura de células microbianas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho agente quelante y dicha mezcla de enzimas de lisis son añadidos a la muestra, al mismo tiempo. 7. Procedimiento de ruptura de células microbianas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho agente quelante es EDTA. 8. Procedimiento de ruptura de células microbianas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la preparación de una muestra microbiana lisada, que contiene proteasa, añadiendo una proteasa a dicha muestra líquida o suspensión. 9. Procedimiento de ruptura de células microbianas según la reivindicación 8, que comprende además: incubar dicha muestra microbiana lisada, que contiene proteasa, a una temperatura de entre aproximadamente 50ºC y aproximadamente 65ºC. 10. Procedimiento de ruptura de células microbianas según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que dicha proteasa es añadida a dicha muestra de células microbianas lisadas. 11. Procedimiento de ruptura de células microbianas según la reivindicación 8, 9 o 10, en el que la proteasa es añadida a dicha muestra líquida o suspensión al mismo tiempo que dicha mezcla de enzimas de lisis. 12. Procedimiento de ruptura de células microbianas según las reivindicaciones 8, 9, 10 o 12, en la que dicha proteasa es proteinasa K. 13. Procedimiento de ruptura de células microbianas según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende la etapa adicional de aislar dichos ácidos nucleicos microbianos liberados. 14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicha etapa de aislamiento comprende añadir un agente caotrópico, un detergente y un soporte de unión de ácidos nucleicos a dicha muestra de células microbianas lisadas, bajo condiciones que permiten la unión de dichos ácidos nucleicos a dicho soporte de unión de ácidos nucleicos. 15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que dicha muestra es seleccionada de entre el grupo que consiste en una muestra de sangre, una muestra de concentrado de hematíes, una muestra de plaquetas, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de orina, una muestra de saliva, una muestra de líquido cefalorraquídeo, una muestra de líquido intersticial, una muestra de biopsia tisular, una muestra de lavado, E05804047 15-11-2011   una muestra de esputo y un muestra de frotis vaginal, dental, rectal, uterino o de una superficie inerte. 16 E05804047 15-11-2011