Nuevas inmunologías multivalentes.

Una inmunoglobulina multivalente que se une específicamente a al menos dos moléculas de la superficie celular de una sola célula,

en que la inmunoglobulina se une específicamente a al menos un primer epítopo y comprende al menos una modificación en al menos una región de bucles estructurales de CH3 de dicha inmunoglobulina que da lugar a una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos para introducir un nuevo sitio ligante de antígenos que se une a una molécula de la superficie celular.

Nuevas inmunoglobulinas multivalentes.

El presente invento proporciona una inmunoglobulina multivalente, o una parte de la misma, que se une específicamente a al menos dos moléculas de la superficie celular de una sola célula, con al menos una modificación en al menos una región de bucles estructurales de dicha inmunoglobulina que determina la unión a un epítopo de dichas moléculas de la superficie celular, en que la inmunoglobulina no modificada no se une significativamente a dicho epítopo.

Los anticuerpos monoclonales tienen utilidad en muchas aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y analíticas.

Se explicará aquí la estructura básica de un anticuerpo usando como ejemplo una inmunoglobulina IgG1 intacta. Se combinan dos cadenas pesadas (H; del inglés, heavy) idénticas y dos cadenas ligeras (L; del inglés, light) idénticas para formar la molécula de anticuerpo con forma de Y. Cada cadena pesada tiene cuatro dominios. Los dominios variables (VH) amino-terminales están en las puntas de la Y. Estos van seguidos de tres dominios constantes: CH1, CH2 y el CH3 carboxi-terminal, en la base del tallo de la Y. Un tramo corto, el conmutador, conecta las regiones variable y constante de la cadena pesada. La bisagra conecta CH2 y CH3 (el fragmento Fc) con el resto del anticuerpo (los fragmentos Fab) . En una molécula de anticuerpo intacta se pueden producir un fragmento Fc y dos fragmentos Fab idénticos por escisión proteolítica de la bisagra. Las cadenas ligeras están formadas por dos dominios, variable (VL) y constante (CL) , separados por un conmutador.

En la región bisagra, enlaces disulfuro conectan las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras están conectadas con las cadenas pesadas por enlaces disulfuro adicionales. Componentes carbohidratados enlazados por Asn están fijados en diferentes posiciones de los dominios constantes, dependiendo de la clase de la inmunoglobulina. En la IgG1, dos enlaces disulfuro en la región bisagra, entre parejas de Cys235 y Cys238, unen las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras están conectadas con las cadenas pesadas por dos enlaces disulfuro adicionales, entre Cys229s de los dominios CH1 y Cys214s de los dominios CL. Componentes carbohidratados están fijados a la Asn306 de cada CH2, lo que genera un acusado abultamiento en el tallo de la Y.

Estas características tienen profundas consecuencias funcionales. Las regiones variables tanto de la cadena pesada (VH) como de la cadena ligera (VL) están situadas en las "puntas" de la Y, donde están dispuestas para reaccionar con el antígeno. Esta punta de la molécula es el lado sobre el que está situado el extremo N de la secuencia de aminoácidos. El tallo de la Y se proyecta de modo que media eficazmente en funciones efectoras, tales como la activación del complemento y la interacción con receptores de Fc, o ADCC y ADCP. Sus dominios CH2 y CH3 sobresalen para facilitar la interacción con proteínas efectoras. El extremo C de la secuencia de aminoácidos, que puede ser denominado "pie" de la Y, está situado en el lado opuesto de la punta.

En los anticuerpos se encuentran dos tipos de cadena ligera denominados lambda (8) y kappa (6) . Una inmunoglobulina dada tiene cadenas 6 o cadenas 8, nunca una de cada. No se han encontrado diferencias funcionales entre los anticuerpos que tienen cadenas ligeras 8 o 6.

En una molécula de anticuerpo, cada dominio tiene una estructura similar de dos hojas beta íntimamente apiladas una contra otra en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura conservada se denomina "pliegue inmunoglobulínico". El pliegue inmunoglobulínico de dominios constantes contiene una hoja de 3 hebras apilada contra una hoja de 4 hebras. El pliegue es estabilizado por enlaces de hidrógeno entre las hebras beta de cada hoja, por enlaces hidrófobos entre restos de hojas opuestas en el interior y por un enlace disulfuro entre las hojas. La hoja de 3 hebras comprende las hebras C, F y G, y la hoja de 4 hebras tiene las hebras A, B, E y D. Las letras A a G representan las posiciones secuenciales de las hebras beta a lo largo de la secuencia de aminoácidos del pliegue inmunoglobulínico.

El pliegue de dominios variables tiene 9 hebras beta dispuestas en dos hojas de 4 y 5 hebras. La hoja de 5 hebras es estructuralmente homóloga a la hoja de 3 hebras de los dominios constantes pero contiene las hebras extra C' y C''. El resto de las hebras (A, B, C, D, E, F, G) tiene una topología igual y una estructura similar a la de sus equivalentes en los pliegues inmunoglobulínicos de los dominios constantes. Como en los dominios constantes, un enlace disulfuro une las hebras B y F de hojas opuestas.

Los dominios variables de ambas cadenas inmunoglobulínicas, la ligera y la pesada, contienen tres bucles hipervariables, o regiones determinantes de la complementariedad (CDRs; del inglés, complementarity-determining regions) . Las tres CDRs de un dominio V (CDR1, CDR2, CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDRs son bucles que conectan hebras beta B-C, C'-C'' y F-G del pliegue inmunoglobulínico. Los restos de las CDRs varían de una molécula inmunoglobulínica a la siguiente, lo que imparte especificidad antigénica a cada anticuerpo.

Los dominios VL y VH de las puntas de las moléculas de anticuerpo están íntimamente apilados de modo que las 6 CDRs (3 de cada dominio) cooperan para construir una superficie (o cavidad) para una unión antigénicamente específica. De este modo, el sitio ligante de antígenos natural de un anticuerpo está compuesto de los bucles que conectan las hebras B-C, C'-C'' y F-G del dominio variable de cadena ligera y las hebras B-C, C'-C'' y F-G del dominio variable de cadena pesada.

En una inmunoglobulina nativa, los bucles que no son bucles de CDR, o no forman parte de la cavidad ligante de antígenos según viene determinada por los bucles de CDR, no tienen una especificidad ligante de antígenos ni ligante de epítopos pero contribuyen a la plegadura correcta de la molécula inmunoglobulínica entera y/o a sus funciones efectoras u otras funciones, y, por lo tanto, son denominados "bucles estructurales" para la finalidad de este invento. En los documentos de la técnica previa se muestra que se ha empleado hasta ahora el andamio de tipo inmunoglobulínico con el fin de manipular el sitio ligante de antígenos existente, introduciendo por ello nuevas propiedades ligantes. Sin embargo, hasta ahora, sólo se han alterado las regiones CDR para la unión de antígenos; en otras palabras, en el caso del pliegue inmunoglobulínico, sólo se ha modificado el sitio ligante de antígenos natural con objeto de cambiar su afinidad o especificidad de unión. Existe un vasto cuerpo bibliográfico en el que se describen diferentes formatos de dichas inmunoglobulinas manipuladas, frecuentemente expresados en forma de fragmentos Fv de cadena sencilla (scFV; del inglés, single-chain Fv) o fragmentos Fab, ya sea presentados en la superficie de partículas de fago o ya sea solublemente expresados en diversos sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos.

En el Documento PCT/EP2006/050059 se describe un método para alterar una inmunoglobulina, que comprende una modificación en una región de bucles estructurales para obtener nuevos sitios ligantes de antígeno. Este método es aplicable en gran medida a inmunoglobulinas y puede ser usado para producir una serie de inmunoglobulinas que se dirijan a una diversidad de antígenos. No se describen explícitamente agentes ligantes multivalentes de dianas de la superficie celular.

En el Documento US2005/266000A1 se describen polipéptidos que comprenden un dominio de armazón variable (VFR) variante de cadena pesada. Un VFR es parte de la cavidad o acanaladura ligante de antígenos que puede entrar en contacto con un antígeno. Los VFRs son parte de la región de bucles de CDR y están situados en un dominio variable en el lado de los bucles de CDR para sostener la unión del antígeno a través de la región de bucles de CDR. Los bucles estructurales distintos de los VFRs no han sido mutados con el fin de alterar un sitio ligante de antígenos.

Las proteínas de superficie celular asociadas con cánceres humanos pueden ser dianas eficaces para una terapia monoclonal. Los anticuerpos pueden provocar respuestas antitumorales mediante modulación de la activación celular o a través del reclutamiento del sistema inmune. Ciertos anticuerpos monoclonales (mAbs; del inglés, monoclonal antibodies) ejercen parte de su efecto por entrecruzamiento de la diana, lo que puede agrupar las dianas y dar lugar a la activación, inhibición o multiplicación... [Seguir leyendo]

1. Una inmunoglobulina multivalente que se une específicamente a al menos dos moléculas de la superficie celular de una sola célula, en que la inmunoglobulina se une específicamente a al menos un primer epítopo y comprende al menos una modificación en al menos una región de bucles estructurales de CH3 de dicha inmunoglobulina que da lugar a una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos para introducir un nuevo sitio ligante de antígenos que se une a una molécula de la superficie celular.

2. Una inmunoglobulina de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la región de bucles estructurales modificada está dentro del dominio constante CH3 de dicha inmunoglobulina, o una parte del mismo.

3. Una inmunoglobulina de acuerdo con la Reivindicación 2, caracterizada por que dicha región de bucles estructurales modificada comprende al menos 6 modificaciones de aminoácido.

4. Una inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que la región de bucles modificada de un CH3 de origen humano comprende al menos una modificación en los aminoácidos 7 a 21, los aminoácidos 25 a 39, los aminoácidos 41 a 81, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 89 a 103 o los aminoácidos 106 a 117, en que la numeración de la posición de los aminoácidos de los dominios es la del IMGT.

5. Una inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que la inmunoglobulina modificada está además combinada con una o más inmunoglobulinas modificadas o con inmunoglobulinas no modificadas, o partes de las mismas, para obtener una inmunoglobulina de combinación.

6. Una inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, que es una molécula de anticuerpo completa, Fc o una parte de la misma.

7. Una inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, que se une específicamente a al menos dos epítopos que difieren entre sí.

8. Un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7.

9. Un método para alterar una inmunoglobulina multivalente de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, que comprende las operaciones de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que se une específicamente a al menos un primer epítopo y que comprende al menos una región de bucles estructurales de CH3;

- modificar al menos un resto nucleotídico de al menos una de dichas regiones de bucles estructurales de CH3 codificadas por dicho ácido nucleico;

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión;

- hacer que se exprese dicha inmunoglobulina modificada;

- hacer que la inmunoglobulina modificada expresada entre en contacto con un segundo epítopo de un antígeno de la superficie celular; y

- determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une específicamente al segundo epítopo.

10. Una inmunoglobulina multivalente de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8 para para uso como un medicamento.