Un método para producir una preparación de hepatocitos multi-crioconservados,

que comprende:

(A) proporcionar hepatocitos de múltiples fuentes que han sido crioconservados y descongelados,

(B) mezclar dichos hepatocitos y someterlos a fraccionamiento en gradiente de densidad para separar loshepatocitos 5 viables de los hepatocitos no viables,

(C) recuperar los hepatocitos viables separados, y

(D) crioconservar los hepatocitos viables recuperados formando con ellos dicha preparación de hepatocitos, endonde son viables más del 70% de los hepatocitos de dicha preparación.

Nuevas composiciones celulares y métodos para su preparación

Campo de la invención:

La presente descripción se refiere a nuevas composiciones celulares (por ejemplo, de hepatocitos, etc.) y a métodos para su preparación y uso. En particular, la invención se refiere a métodos para el tratamiento de dichas células de modo que permitan su crioconservación y descongelación repetidas aunque manteniendo su viabilidad sustancial

Antecedentes de la invención:

Los hepatocitos son células parenquimales del hígado y constituyen el 60-80% de la masa citoplásmica del hígado. Los hepatocitos tienen un papel clave en la destoxificación, modificación y excreción de las sustancias exógenas y endógenas (Ponsoda, X. et al. (2004) "Drug Metabolism By Cultured Human Hepatocytes: How Far Are We From The In Vivo Reality?", Altern. Lab. Anim. 32 (2) :101-110) . Una de las funciones destoxificadoras de los hepatocitos es transformar el amoniaco en urea para su excreción. También son importantes en la síntesis y almacenamiento de las proteínas, en la transformación de los hidratos de carbono y en la síntesis del colesterol, sales biliares y fosfolípidos (Postic, C. et al. (2004) "Role Of The Liver In The Control Of Carbohydrate And Lipid Homeostasis”, Diabetes Metab. 30 (5) :398-408) . El hepatocito es la única célula en el organismo que fabrica albúmina, fibrinógeno y el grupo protrombina de los factores de coagulación. Es el sitio principal para la síntesis de las lipoproteínas, ceruloplasmina, transferrina y glicoproteínas. Los hepatocitos fabrican sus propias proteínas estructurales y enzimas intracelulares. Los hepatocitos son también importantes depósitos de vitamina B12 y hierro.

Debido a estas propiedades, los hepatocitos aislados y cultivados han llegado a ser muy atractivos como sistemas modelos para el estudio de las funciones hepáticas (Chesne, C. et al. (1993) "Viability And Function In Primar y Culture Of Adult Hepatocytes From Various Animal Species And Human Beings After Cr y opreservation”, Hepatology 18 (2) :406-414; Guillouzo, A. et al. (1986) "Isolated and Cultured Hepatocytes” Paris: les Editions INSERM and London: John Libbey Eurotext) ; Ponsoda, X. et al. (2004) "Drug Metabolism By Cultured Human Hepatocytes: How Far Are We From The In Vivo Reality?", Altern. Lab. Anim. 32 (2) :101-110; Gomez-Lechon, M.J. et al. (2004) "Human Hepatocytes In Primar y Culture: The Choice To Investigate Drug Metabolism In Man”, Curr. Drug Metab. 5 (5) :443462; Lemaigre, F. et al. (2004) "Liver Development Update: New Embr y o Models, Cell Lineage Control, And Morphogenesis”, Curr. Opin. Genet. Dev. 14 (5) :582-590; Nanji, A. A. (2004) "Animal Models Of Nonalcoholic Fatty Liver Disease And Steatohepatitis”, Clin. Liver Dis. 8 (3) :559-574; Hewitt, N.J. et al. (2004) Cr y opreserved Rat, Dog And Monkey Hepatocytes: Measurement Of Drug Metabolizing Enzymes In Suspensions And Cultures”, Hum. Exp. Toxicol. 23 (6) :307-316) .

Además de su uso en modelos hepáticos, los hepatocitos pueden ser potencialmente usados para producir hígados bioartificiales (abreviadamente BAL, del inglés BioArtificial Liver) o en el trasplante de hepatocitos que pueden proporcionar funciones hepáticas a individuos que padecen enfermedades hepáticas o insuficiencia hepática. Los hígados bioartificiales (BAL) han sido descritos por Anand, A. C. (1996) "Bioartificial Livers: The State Of The Art", Trop. Gastroenterol. 17 (4) : 197-198, 202-211; Gan, J. H. et al. (2005) ; "Hybrid Artificial Liver Support System For Treatment Of Severe Liver Failure", World J. Gastroenterol. 11 (6) :890-894; Fukuda, J. et al. (2004) "Hepatocyte Organoid Culture In Elliptic Hollow Fibers To Develop A Hybrid Artificial Liver", Int. J. Artif. Organs. 27 (12) :10911099; Meng, Q. et al. (2004) "Hepatocyte Culture In Bioartificial Livers With Different Membrane Characteristics", Biotechnol. Lett. 26 (18) :1407-1412; Sekido, H. et al. (2004) "Usefulness Of Artificial Liver Support For Pretransplant Patients With Fulminant Hepatic Failure", Transplant. Proc. 36 (8) :2355-2356; documentos WO03/105663A2, WO05/000376A2 y Patente de EE.UU. Nº 6.759.245. El trasplante de hepatocitos ha sido descrito por Chan, C. et al. (2004) "Hepatic Tissue Engineering For Adjunct And Temporar y Liver Support: Critical Technologies", Liver Transpl. 10 (11) :1331-1342; Lee, S.W. et al. (2004) "Hepatocyte Transplantation: State Of The Art And Strategies For Overcoming Existing Hurdles", Ann. Hepatol. 3 (2) :48-53; Horslen, S. P. (2004) "Hepatocyte Transplantation", Transplantation 77 (10) :1481-1486; Burlina, A.B. (2004) "Hepatocyte Transplantation For Inborn Errors Of Metabolism", J. Inherit. Metab. Dis. 27 (3) :373-83; y Fox, I.J. et al. (2004) "Hepatocyte Transplantation” Am. J. Transplant.4 Suppl. 6:7-13.

Un factor limitante en el desarrollo de dichos sistemas modelos y en el desarrollo de hígados bioartificiales (BAL) ha sido la fuente irregular y la disponibilidad limitada de los hepatocitos, especialmente los hepatocitos humanos. Los hepatocitos frescos se obtienen sólo de resecciones hepáticas o hígados no trasplantables de donantes de multiórganos (Lloyd, T. D. R. et al. (2003) Cr y opreservation Of Hepatocytes: A Review Of Current Methods For Banking”, Cell and Tissue Culture Banking 4:3-15) . El suministro de dicho tejido es desigual y con frecuencia geográficamente inconveniente debido a la vida útil funcional limitada del tejido hepático (Smrzova, J. et al. (2001) "Optimization Of Porcine Hepatocytes Cr y opreservation By Comparison Of Viability And Enzymatic Activity Of Fresh And Cr y opreserved Cells", Acta Veterinaria Brunensis 70:141-147) .

Una propuesta para resolver este problema implica el desarrollo de condiciones de conservación de los hepatocitos que permitan que los hepatocitos sean mantenidos durante cierto tiempo conservando sus funciones celulares. Para resolver esta necesidad se han desarrollado métodos de crioconservación para la conservación de hepatocitos (véase, Lloyd, T. D. R. et al. (2003) "Cr y opreservation Of Hepatocytes: A Review Of Current Methods For Banking”, Cell and Tissue Culture Banking", 4:3-15; Loretz, L. J. et al. (1989) "Optimization Of Cr y opreservation Procedures For Rat And Human Hepatocytes", Xenobiotica. 19 (5) :489-498; Shaddock, J. G. et al. (1993) "Cr y opreservation And Long-Term Storage Of Primar y Rat Hepatocytes: Effects On Substrate-Specific Cytochrome P450-Dependent Activities And Unscheduled DNA Synthesis", Cell Biol Toxicol. 9 (4) :345-357; Novicki, D. L. et al. (1982) "Cr y opreservation Of Isolated Rat Hepatocytes", In Vitro. 18 (4) :393-399; Zaleski, J. et al. (1993) "Preservation Of The Rate And Profile Of Xenobiotic Metabolism In Rat Hepatocytes Stored In Liquid Nitrogen", Biochem Pharmacol. 46 (1) :111-116) . Típicamente, dichas medidas comprenden conservación en nitrógeno líquido (-196ºC) o en nitrógeno gaseoso congelado (-150ºC) . Se ha encontrado que la capacidad para recuperar células descongeladas viables depende de múltiples factores, tales como la velocidad de congelación, la concentración de hepatocitos, el tipo de crioconservante empleado y la temperatura de enfriamiento final. Típicamente se han empleado concentraciones celulares de 106-107 células/mL. Los hepatocitos aislados se incuban típicamente en suspensión durante un periodo (por ejemplo, 4-48 horas) para permitir que se recuperen del proceso de aislamiento. A continuación, se añade un crioconservante (tal como glicerol, DMSO, polivinilpirrolidona o dextrano) y se congelan los hepatocitos. La técnica ha desarrollado diversos procesos de congelación, diseñados todos para minimizar o evitar la presencia de hielo intracelular. Las velocidades de congelación varían típicamente desde -0, 05ºC/min hasta -50ºC/min (véase, Lloyd,

T.D.R. et al. (2003) "Cr y opreservation Of Hepatocytes: A Review Of Current Methods For Banking", Cell and Tissue Culture Banking 4:3-15) .

Aunque el desarrollo de los métodos de crioconservación para la conservación de los hepatocitos ha facilitado significativamente la disponibilidad de los hepatocitos humanos, se ha encontrado que la crioconservación causa una disminución significativa de la viabilidad celular (por ejemplo, 25-35%) (Dou, M. et al. (1992) "Thawed Human Hepatocytes In Primar y Culture", Cr y obiology 29:454-469; Alexandre, E. et al. (2002) "Cr y opreservation Of Adult Human Hepatocytes Obtained From Resected Liver Biopsies", Cr y obiology 44:103-113) . Coundouris, J. A. et al. (1993) encontraron una viabilidad del 67% después de 24 horas, que disminuía hasta el 49% después de 14 días... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una preparación de hepatocitos multi-crioconservados, que comprende:

(A) proporcionar hepatocitos de múltiples fuentes que han sido crioconservados y descongelados,

(B) mezclar dichos hepatocitos y someterlos a fraccionamiento en gradiente de densidad para separar los 5 hepatocitos viables de los hepatocitos no viables,

(C) recuperar los hepatocitos viables separados, y

(D) crioconservar los hepatocitos viables recuperados formando con ellos dicha preparación de hepatocitos, en donde son viables más del 70% de los hepatocitos de dicha preparación.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho fraccionamiento en gradiente de densidad comprende una 10 centrifugación en gradiente de densidad en PercollTM .

3. El método de la reivindicación 1, en donde dichos hepatocitos se seleccionan del grupo que consiste en hepatocitos humanos, hepatocitos porcinos, hepatocitos de simios, hepatocitos caninos, hepatocitos felinos, hepatocitos bovinos, hepatocitos equinos, hepatocitos ovinos y hepatocitos de roedores.

4. El método de la reivindicación 3, en donde dichos hepatocitos son hepatocitos humanos.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas múltiples fuentes son del mismo género, raza o estado de salud.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde los hepatocitos de dicha preparación mezclada de hepatocitos proporcionan dicha preparación mezclada con un nivel deseado de actividad metabólica.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha actividad metabólica se selecciona del grupo que consiste en

cumarina (COUM) , dextrometoríano (DEX) , etoxicumarina (ECOD) , glucurónido de 7-hidroxicumarina (7-HCG) , sulfato de 7-hidroxicumarina (7-HCS) , mefinitoína (MEPH) , testosterona (TEST) , fenacetina (PHEN) y clorzoxazona (CZX) .

8. El método de la reivindicación 1, en donde más del 80% de los hepatocitos de dicha preparación son viables.