NUEVAS CEPAS DE DUGANELLA AISLADAS DE LA RIZOSFERA DE OLIVO SILVESTRE Y CULTIVADO Y SU USO EN LA PRODUCCIÓN DE VIOLACEÍNA.

Nuevas cepas de duganella aisladas de la rizosfera de olivo silvestre y cultivado y su uso en la producción de violaceína.



La presente invención se refiere a unas cepas bacterianas de Duganella spp. obtenidas de la rizosfera de olivos silvestres y cultivados. Preferentemente las cepas son CECT 7779, CECT 7780 y CECT 7781 y más preferentemente la cepa bacteriana es CECT 7780. Además, la presente invención se refiere a sus combinaciones con otros microorganismos y a las composiciones que comprenden los productos anteriores, así como a un procedimiento para la producción de violaceína y a la violaceína producida para su aplicación biotecnológica y agronómica.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201031655.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: MONTES BORREGO,MIGUEL, ARANDA OCAMPO,Sergio, LANDA DEL CASTILLO,BLANCA B, CASTILLO CASTILLO,Miguel.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K31/40 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › que tienen ciclos con cinco eslabones con un nitrógeno como único heteroátomo de un ciclo, p. ej. sulpirida, succinimida, tolmetina, buflomedil.
  • A61P31/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos.
  • C12N1/20 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Bacterias; Sus medios de cultivo.
  • C12P17/16 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 17/00 Preparación de compuestos heterocíclicos que contienen O, N, S, Se o Te como únicos heteroátomos del ciclo (C12P 13/04 - C12P 13/24 tienen prioridad). › que contienen varios heterociclos.
  • C12R1/01 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Bacterias o actinomicetos.

PDF original: ES-2388662_A1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

NUEVAS CEPAS DE DUGANELLA AISLADAS DE LA RIZOSFERA DE OLIVO SILVESTRE Y CULTIVADO Y SU USO EN LA PRODUCCiÓN DE VIOLACEíNA.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología y agronomía. En concreto, la presente invención se refiere a unas cepas bacterianas de Ouganella spp. obtenidas de la rizosfera de olivos silvestres y cultivados. Preferentemente las cepas son CECT 7779, CECT 7780 y CECT 7781 y más preferentemente la cepa bacteriana es CECT 7780. Además, la presente invención se refiere a sus combinaciones con otros microorganismos y a las composiciones que comprenden los productos anteriores, así como a un procedimiento para la producción de violaceína y a la violaceína producida para su aplicación biotecnológica y agronómica.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

En las últimas décadas, las interacciones planta-microorganismo que ocurren en la rizosfera han sido objeto de considerables estudios ya que la rizosfera se considera un potencial reservorio para el descubrimiento de especies microbianas de diverso interés biotecnológico (Wen-Jun et al., 2004. International Journal of Systematic and Evolutionar y Microbiology 54, 18111814; Ryan et al., 2009. Plant & Soil 321, 363-383) . Los microorganismos del suelo y la rizosfera han evolucionado funciones que les permiten sobrevivir y poder soportar la fuerte competición que caracteriza la mayoría de esos hábitats. Las bacterias de la rizosfera pueden producir metabolitos secundarios novedosos con potencial uso como fármacos y antibióticos los cuales pueden tener aplicación en humanos, veterinaria, medicina, agricultura o industria.

La rizosfera de árboles leñosos silvestres, es un medio ambiente inexplorado que puede constituir una buena fuente de nuevas bacterias productoras de compuestos bioactivos. Entre los árboles silvestres y cultivados, el olivo es una de las especies de mayor longevidad y de mayor riqueza en biodiversidad genética. Por miles de años, el olivo cultivado ha sido cultural y económicamente el principal cultivo oleaginoso en la cuenca del Mediterráneo, donde se encuentran cerca de 9.5 millones de hectáreas de cultivo. El olivo contiene una alta fuente de variabilidad genética, y ésta en la cuenca del Mediterráneo se puede encontrar principalmente en dos formas: olivo silvestre (Olea europaea subsp. europa ea varo sylvestrís (Miller) Hegi) y olivo cultivado (Olea europaea subsp. europaea varo europa ea L.) (Green, 2002, Kew Bulletin 57, 91-140) . La larga historia del cultivo del olivo (más de 8.000 años) (Zohar y y Spiegel-Roy, 1975, Science 187, 319-327) Y la amplia hibridación entre árboles silvestres y cultivados de olivo hacen del occidente Mediterráneo, y fundamentalmente del sur de la Península Ibérica (Besnard et al., 2002, Theoretical & Applied Genetics 104, 1353-1361) la región con mayor diversidad genética para este árbol (Lumaret y Ouazzani 2001, Nature 413, 700) .

La longevidad y alta diversidad genética del olivo puede favorecer la selección de poblaciones microbianas específicas y bien adaptadas a la rizosfera de este cultivo que pueden constituir reservorios únicos de microorganismos con interés biotecnológico.

Por otro lado, las moléculas pigmentadas producidas por algunos de estos microorganismos, han sido objeto de considerables investigaciones que han ayudado a revelar cómo esas moléculas pueden proveer a ciertos microorganismos una ventaja para sobrevivir en su medio ambiente (Liu y Nizet, 2009. Trends in Microbiology 17, 406-413) .

Entre estos pigmentos se encuentra la violaceína, un metabolito secundario con coloración azul-morada producido por bacterias con importantes aplicaciones biológicas, biotecnológicas e industriales. Entre las actividades biológicas se incluyen: actividad antibacteriana, anti-viral, anti-tripanocida, antiprotozoa y anti-ulcerogénica (Durán y Menck, 2001. Critical Reviews in Microbiology 27, 201-222; Durán et al., 2007. Biotechnology & Applied

Biochemistr y 48, 127-133) . Además, puede tener una prometedora aplicación

clínica en el tratamiento del cáncer ya que es efectivo contra leucemia, cáncer

pulmonar y linfoma celular (De Azevedo et al., 2000. Phenomena and

Macrocyclic Chemistr y 37, 93-101; Durán et al., 2007. Biotechnology & Applied

Biochemistr y 48, 127-133) , puede ser usada en terapias dermatológicas contra

la radiación ultravioleta (UV) (Dessaux et al., 2004. La Revue de Medicine

Interne 25, 659-662) , como tinte biológico en la industria para la tinción de

fibras naturales y sintéticas (Shirata et al., 2000. Japan Agricultural Research

Quarterly 34, 131-140) Y puede proporcionar una ventaja para la supervivencia 10 de ciertos microorganismos en su medio ambiente natural.

La violaceína es producida por varias bacterias Gram-negativas que habitan suelos y mares en medio ambientes tropicales, subtropicales y glaciares entre las que se incluyen Chromobacteríum víolaceum, la primera y más estudiada 15 bacteria descrita como productora de violaceína (Durán y Menck, 2001. Critical Reviews in Microbiology 27, 201-222) , Collímonas sp. (Hakvag et al., 2009. Marine Drugs 7, 576-588) , Ouganella sp. B2 (Wang et al., 2009. Biochemical Engineering Journal 44, 119-124) , lodobacter fluvíatíle (Logan, 1989. International Journal of Systematic Bacteriology 39, 450-456) , 20 Janthínobacteríum lívídum (Shivaji et al., 1991. Polar Biology 11, 267-271; Lu et al., 2009. Biochemical Engineering Journal 43, 135-141) , Mícrobulbífer sp. (Matz et al., 2008. PLoS ONE 3, e2744. doi:1 0.1371/ journal.pone.0002744) , Pseudoalteromonas luteovíolacea, Pseudoalteromonas tunícata y Pseudoalteromonas ulvae (Matz et al., 2008. PLoS ONE 3, e2744. doi:10.1371/ 25 journal.pone.0002744; Yang et al., 2007. Letters in Applied Microbiology 44,

625-630) .

Sin embargo, la ineficiente producción de violaceína ha restringido las aplicaciones industriales de este pigmento, y por tanto persiste el problema de 30 encontrar nuevas fuentes productoras de violaceína en cantidades susceptibles

de explotación comercial.

EXPLICACiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a las cepas bacterianas que tienen una identidad de entre un 98, 6% y un 99, 3% con respecto al fragmento de AON de 5 SEO ID NO: 1 del gen de AONr 16S, de entre un 93, 7% y un 95, 7% con respecto al fragmento de AON de SEO ID NO: 2 del gen gyrB y de entre un 89, 8% y un 90, 8% con respecto al fragmento de AON de SEO ID NO: 3 del gen vioA. Preferentemente la cepa bacteriana se selecciona de entre las cepas CECT 7779, CECT 7780 y CECT 7781 y más preferentemente la cepa

bacteriana es CECT 7780. Además, la presente invención se refiere a sus combinaciones con otros microorganismos y a las composiciones que comprenden los productos anteriores, así como a un procedimiento para la producción de violaceína y a la violaceína producida para su aplicación biotecnológica y agronómica.

Las cepas aisladas en la presente invención han sido obtenidas de la rizosfera de olivo, una de las especies de más larga longevidad y riqueza en biodiversidad genética, y han sido caracterizadas fisiológica, bioquímica y genéticamente como nuevas cepas pertenecientes al género Ouganella spp. 20 productoras de violaceína (ejemplo 3) . Estas cepas pudieron ser diferenciadas en base a los análisis fenotípicos y genéticos, en dos grupos de acuerdo al huésped de origen (olivo silvestre versus olivo cultivado) (ejemplo 2 y 3) . Los olivos silvestres representan un cluster genético diferenciado constituyendo un pool genético independiente de los cultivares de olivo locales (Belaj et al., 2010.

Scientia Horticulturae 124, 323-330) .

Así, las cepas aisladas en la presente invención, CICYT-60 (con número de depósito CECT 7780) , LO-22 (con número de depósito CECT 7779) , Mico-M (con número de depósito CECT 7781) , LOBA-24, Baetica-33, Mico-C y Mico30 M2, pueden ser agrupadas según su origen en cepas de Ouganella spp. procedentes de olivos silvestres (LOBA-24, Baetica-33 y LO-22) y cepas de

Ouganella spp. procedentes de olivos cultivados (CICYT-60, Mico-M, Mico-C y Mico-M2) .

Todas las cepas aisladas y preferentemente las cepas CECT 7779, CECT 7780 Y CECT 7781 fueron capaces de producir violaceína a altos niveles de forma natural, es decir, sin intentar ninguna... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Cepa bacteriana del género Duganella spp. productora de violaceína aislada de la rizosfera de olivos cultivados y/o silvestres con una 5 identidad: a. de entre un 98, 6 % Y un 99, 3% con respecto al fragmento de AON de SEQ ID NO: 1 del gen de AONr 16S, b. de entre un 93, 7 % Y un 95, 7% con respecto al fragmento de AON 10 de SEQ ID NO: 2 del gen gyrB, y c. de entre un 89, 8 % Y un 90, 8% con respecto al fragmento de AON de SEQ ID NO: 3 del gen vioA. 2. Cepa bacteriana según la reivindicación 1, donde dicha cepa se 15 selecciona de entre las cepas CECT 7779, CECT 7780 o CECT 7781. 3. Cepa bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la cepa es CECT 7780. 20 4. Combinación de microorganismos que comprende al menos una cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5. Combinación de microorganismos según la reivindicación 4, que además comprende al menos otro microorganismo. 25 6. Violaceína producida por la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o por la combinación de microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5. 30 7. Extracto bacteriano que comprende la violaceína según la reivindicación 6.

8. Composición que comprende la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; la combinación de microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5; la violaceína según la reivindicación 6; o el extracto bacteriano según la reivindicación 7.

9. Composición según la reivindicación 8, donde dicha composición es una composición farmacéutica.

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, donde además

comprende un vehículo y/o un excipiente farmacológicamente aceptables.

11. Composición según la reivindicación 8, donde dicha composición es un producto fitosanitario.

12. Composición según la reivindicación 11, donde el producto fitosanitario es un bactericida.

13. Composición según la reivindicación 11 , donde el producto fitosanitario 20 es un fungicida.

14.Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde además comprende otra sustancia activa.

15. Uso de la composición según la reivindicación 12, para prevenir la acción de al menos una bacteria Gram-positiva o para provocar la muerte de dicha bacteria.

16. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; de la

combinación de microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5; de la violaceína según la reivindicación 6; del extracto bacteriano según la reivindicación 7; o de la composición según la reivindicación 8, para la fabricación de un medicamento.

17. Método para la producción de violaceína o para la producción del 5 extracto bacteriano que contiene violaceína, que comprende:

a. Seleccionar una cepa bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la combinación de microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5,

b. cultivar la cepa o la combinación de microorganismos del paso (a) en condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento y desarrollo del microorganismo, y

c. extraer la violaceína o el extracto bacteriano del cultivo del paso (b) .


 

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