NUEVA VARIANTE DE CELULASA CBH1 DE HYPOCREA JECORINA.

REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS [0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional US No. 60/404,063, presentada el 16 de agosto de (Expediente del agente No. GC772P), de la Solicitud Provisional US No. 60/458,853 presentada el 27 de marzo de 2003 (expediente del agente No. GC772-2P), de la Solicitud Provisional US No 60/458,368 presentada el 21 de marzo de 2003 (expediente del agente No. GC793P) y de la Solicitud Provisional US No 60/458,696 presentada el 27 de marzo de 2003 (expediente del agente No. GC793-2P). DECLARACIÓN CON RESPECTO A LOS DERECHOS DE LAS INVENCIONES REALIZADAS BAJO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO APOYADO FEDERALMENTE [0002] Partes de este trabajo obtuvieron fondos por el subcontrato No. ZCO-0-30017-01 con la National Renewable Energy Laboratory bajo el Contrato Principal No. DE-AC36-99GO10337 con el Departamento de energía de los Estados Unidos. Por consiguiente, el Gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre la invención. CAMPO DE LA INVENCIÓN [0003] La presente invención se refiere a enzimas de celobiohidrolasas variantes y secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa. La presente invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores, y células huésped que comprenden las secuencias de ácido nucleico, así como métodos para producir polipéptidos CBH variantes recombinantes. REFERENCIAS [0004] 1. Sheehan y Himmel Biotechnology Progress 15, pp 817-827 (1999) 2. Mattl Linko Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases pp 9-11 (1993) 3. Tuula T. Teeri Trends In Biotechnology 15, pp 160-167 (1997) 4. T.T. Teeri et al. Spec. Publ.- R. Soc. Chem., 246 (Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering), pp 302-308. (1999) 5. PDB reference 20VW: Sulzenbacher, G., Schulein, M., Davies, G. J. Biochemistry 36 pp. 5902 (1997) PDB reference 1A39: Davies, G. J., Ducros, V., Lewis, R. J., Borchert, T. V., Schuleln, M. Journal of Biotechnology 57 pp. 91 (1997) 7. PDB reference 6CEL: Divne, C., Stahlberg, J., Teerl, T. T., Jones, T. A. Journal of Molecular Biology 275 pp. 309 (1998) 8. PDB reference 1 EG1: Kleywegt, G. J., Zou, J. Y., Divne, C., Davies, G. J., Sinning, I., Stahlberg, J., Reinikainen, T., Srisodsuk, M., Teeri, T. T., Jones, T. A. Journal of Molecular Biology 272 pp. 383 (1997) 9. PDB reference 1 DY4 (8CEL): J. Stahlberg, H. Henriksson, C. Divne, R. Isaksson, G. Pettersson, G. Johansson, T. A. Jones ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0005] La celulosa y la hemicelulosa son los materiales vegetales más abundantes producidos mediante fotosíntesis. Pueden degradarse y utilizarse como fuente de energía por parte de numerosos microorganismos, incluidos bacterias, levaduras y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de hidrólisis de los sustratos poliméricos de azúcares monoméricas (Aro et al., J. Biol. Chem., vol. 276, no. 26, pp. 24309-24314, Junio 29, 2001)). Como los límites de los recursos no renovables se acercan, el potencial de la celulosa para convertirse en un importante recurso de energía renovable es enorme (Krishna et al., Bioresource Tech. 77:193-196, 2001). La utilización eficaz de la celulosa a través de procesos biológicos, es una estrategia para superar la escasez de alimentos, forrajes y combustibles (Ohmiya et al., Biotechnol. Gen. Engineer. Rev. vol. 14, pp. 365-414, 1997). [0006] Las celulasas son enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces beta-1,4-glucano y beta-D glucosídicos), dando lugar a la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos, y similares. Las celulasas han sido tradicionalmente divididas en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH") y beta-glucosidasas ([beta] -D-glucósido glucohidrolasa; EC 3.2.1.21) ("BG"). (Knowles et al., TIBTECH 5, 255-261, 1987; Shulein, Methods Enzymol., 160, 125, pp. 234-243, 1988). Las endoglucanasas actúan principalmente en las partes amorfas de la fibra de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas también son capaces de degradar la celulosa cristalina (Nevalainen y Penttila Mycota, 303-319, 1995). De este modo, la presencia de una celobiohidrolasa en un sistema de celulasas es necesaria para la solubilización eficiente de la celulosa cristalina (Suumakki, et al. Cellulose 7:189-209, 2000). La beta-glucosidasa actúa para liberar a unidades 2 E03788539 04-01-2012   de D-glucosa a partir de celobiosa, celooligosacáridos, y otros glucósidos (freer, J. Biol. Chem. vol. 268, no. 13, pp. 9337-9342, 1993). [0007] Se sabe que las celulasas son producidas por un gran número de bacterias, levaduras y hongos. Algunos hongos producen un sistema de celulasas completo capaces de degradar las formas cristalinas de la celulosa, de manera que las celulasas se producen fácilmente en grandes cantidades a través de la fermentación. Los hongos filamentosos desempeñan un papel especial, ya que muchas levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, carecen de la capacidad para hidrolizar la celulosa. Ver, por ejemplo, Aro et al., 2001; Aubert et al., 1988; Wood et al., Methods In Enzymology, vol. 160, no. 9, pp. 87-116, 1988, y Coughlan, et al., "Comparative Biochemistry of Fungal and Bacterial Cellulolytic Enzyme Systems" Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, pp. 11-30 1988. [0008] Las clasificaciones de la celulasa fúngica de CBH, EG y BG pueden ampliarse para incluir múltiples componentes dentro de cada clasificación. Por ejemplo, se han aislado múltiples CBH, EG y BG de una variedad de fuentes fúngicas, incluyendo Trichoderma reesei, que contiene genes conocidos para 2 CBHS, es decir, CBH I y CBH II, por lo menos 8 EGs, es decir, EG I, EG II, EG III, EGIV, EGV, EGVI, EGVII y EGVIII, y por lo menos 5 BGs, es decir, BG1, BG2, BG3, BG4 y BG5. [0009] Con el fin de convertir eficientemente la celulosa cristalina en glucosa es necesario el sistema de celulasas completo que comprende componentes de cada una de las clasificaciones CBH, EG y BG, con componentes aislados menos eficaces en la hidrólisis de la celulosa cristalina ((Filho et al., Can. J. Microbiol. 42:1-5, 1996). Se ha observado una relación sinérgica entre los componentes de la celulasa de distintas clasificaciones. En particular, las celulasas tipo EG y las celulasas tipo CBH interaccionan de manera sinérgica para degradar más eficientemente la celulosa. Ver, por ejemplo. Wood, Biochemical Society Transactions, 611th Meeting, Galway, vol, 13, pp. 407-410, 1985. [0010] Las celulasas se conocen en la técnica por ser útiles en el tratamiento de tejidos con el fin de mejorar la capacidad de limpieza de las composiciones de detergente, por su uso como un agente suavizante, para mejorar el tacto y la apariencia de los tejidos de algodón y similares (Kumar et al., Textile Chemist and Colorist, 29:37-42, 1997). [0011] Se han descrito composiciones de detergente que contienen celulasa con un mejor rendimiento de limpieza (patente US 4.435.307; solicitudes GB 2.095.275 y 2.094.826) y para su uso en el tratamiento de la tela para mejorar el tacto y la apariencia del tejido (patentes US 5.648.263, 5.691.178, y 5.776.757; solicitud GB 1.358.599; The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report, vol. 24, pp. 54-61, 1986). [0012] Por lo tanto, las celulasas producidas en hongos y bacterias han recibido una atención considerable. En particular, la fermentación de la Trichoderma spp. (por ejemplo, Trichoderma longibrachiatum o Trichoderma reesei) se ha demostrado que produce un sistema completo de celulasas capaces de degradar formas cristalinas de la celulosa. [0013] WO01/04284 describe que las tres variantes de CBH I N45A, N270A y N384A presentan niveles reducidos de glicosilación. [0014] Gross et al., 2002, Biophysical J., vol. 82, no. 1, parte 2, página 459a describe el cambio de propiedades de CBH I de Tricoderma reesei por mutaciones de un único aminoácido. [0015] Aunque las composiciones de celulasa se han descrito previamente, aún existe la necesidad de nuevas y mejoradas composiciones de celulasas para utilizar en detergentes del hogar, composiciones para el lavado a la piedra o detergentes de lavandería, etc. Las celulasas que muestran un mejor rendimiento son de particular interés. BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN [0016] La presente invención proporciona una proteína celulasa aislada, identificada aquí como una variante de CBH I, y ácidos nucleicos que codifican una variante de CBH I. [0017] Se describe aquí una variante de celulasa CBH I, donde dicha variante comprende una sustitución o deleción en una posición correspondiente a uno o más de los residuos S8, Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92, N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S278, S279, K286, L288,... [Seguir leyendo]

1. Variante de celulasa CBH I, en la que dicha variante comprende una sustitución en la posición correspondiente al residuo P227(L/T/A) en CBH I de Hypocrea jecorina (SEC ID NO: 2), en la que dicha variante de celulasa CBH I tiene una mayor temperatura de fusión. 2. Variante de celulasa CBH I según la reivindicación 1, en la que dicha variante CBH I consiste esencialmente en las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en i. P227L/E325K/Q487L; ii. P227T/T484S/F352L; iii. S8P/N49S/A68T/S113N/P227L; v. T41I/A112E/P227L/S278P/T296P; v. S8P/N49S/A68T/A112E/P227L; vi. S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L; vii. G22D/N49S/A68T/P227US278P/T296P; viii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P; ix. G22D/N49S/A68T/N1031/S113N/P227US278P/T296P; x. G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P; xi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/ T296P; xii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R; xiii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/ T296P/N301 R; xiv. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/ N301R; xv. S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R; xvi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R; xvii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I; xviii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I: xix. S8P/T41I/N49S/A68T/ S92T/S113N/P227L/D249K/S411F; xx. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F; xxi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S198T/P227L/D249K/ T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F; xxii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P /S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/ S411F/T462I: xxiii. S8P/G22D/T4D/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/ T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/ V403D/S411F/T462I en CBH I de Hypocrea jecorina (SEC ID NO: 2), en la que dicha variante de celulasa CBH I tiene una mayor temperatura de fusión. 3. Ácido nucleico que codifica una variante de CBH I según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2. 4. Vector que comprende un ácido nucleico que codifica una variante de CBHI según la reivindicación 3. 5. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 4. 6. Método de producción de una variante de CBH I que comprende las etapas de: (a) cultivar la célula huésped según la reivindicación 5 en un medio de cultivo adecuado bajo condiciones adecuadas para producir la variante de CBH I; (b) obtener dicha variante de CBH I producida. 7. Composición detergente que comprende un tensoactivo y una variante de CBH I, en la que dicha variante de CBH I comprende una variante de CBH I según la reivindicación 1. 8. Detergente según la reivindicación 7, en el que dicho detergente es un detergente de lavandería. 9. Detergente según la reivindicación 8, en el que dicho detergente es un detergente para platos. 10. Aditivo alimenticio que comprende una variante de CBH I según la reivindicación 1. 11. Método de tratamiento de pulpa de madera que comprende poner en contacto dicha pulpa de madera con una variante de CBH I según la reivindicación 1. 12. Método de conversión de biomasa en azúcares que comprende poner en contacto dicha biomasa con una variante de CBH I según la reivindicación 1. E03788539 04-01-2012   Figura 1 Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de Cel7A de Hypocrea jecorina 36 E03788539 04-01-2012   Figura 2 37 E03788539 04-01-2012   Figura 3A 38 E03788539 04-01-2012   Figura 3B 39 E03788539 04-01-2012   Figura 4 E03788539 04-01-2012   Figura 5A Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante L225F de Cel7A de Hypocrea jecorina 41 E03788539 04-01-2012   Figura 5B Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante S113D de Cel7A de Hypocrea jecorina 42 E03788539 04-01-2012   Figura 5C Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante A77D de Cel7A de Hypocrea jecorina 43 E03788539 04-01-2012   Figura 5D Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante L288F de Cel7A de Hypocrea jecorina 44 E03788539 04-01-2012   Figura 5E Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante L299F de Cel7A de Hypocrea jecorina E03788539 04-01-2012   Figura 5F Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante N301K de Cel7A de Hypocrea jecorina 46 E03788539 04-01-2012   Figura 5G Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante T356L de Cel7A de Hypocrea jecorina 47 E03788539 04-01-2012   Figura 5H Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante G430F de Cel7A de Hypocrea jecorina 48 E03788539 04-01-2012   Figura 5I Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante T246/Y371C de Cel7A de Hypocrea jecorina 49 E03788539 04-01-2012   Figura 5J Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante T246A/R251A/Y252A de Cel7A de Hypocrea jecorina E03788539 04-01-2012   Figura 5K Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante T380G/Y381D/R394A de Cel7A de Hypocrea jecorina 51 E03788539 04-01-2012   Figura 5L Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante T380G/Y381D/R394A de Cel7A de Hypocrea jecorina con los residuos 381 a 393 eliminados 52 E03788539 04-01-2012   Figura 5M Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante Y252Q/D259W/S342Y de Cel7A de Hypocrea jecorina 53 E03788539 04-01-2012   Figura 6A 54 E03788539 04-01-2012   Figura 6B E03788539 04-01-2012   Figura 6C 56 E03788539 04-01-2012   Figura 6D 57 E03788539 04-01-2012   Figura 7A 58 E03788539 04-01-2012   Figura 7B 59 E03788539 04-01-2012   Figura 8A-1 E03788539 04-01-2012   Figura 8A-2 61 E03788539 04-01-2012   Figura 8B-1 62   Figura 8B-2 63   Figura 8C-1 64   Figura 8C-2   Figura 8D-1 66   Figura 8D-2 67   Figura 8E-1 68   Figura 8E-2 69   Figura 8F-1   Figura 8F-2 71   Figura 8G-1 72   Figura 8G-2 73   Figura 8H-1 74   Figura 8H-2   Figura 8I-1 76   Figura 8I-2 77   Figura 8J-1 78   Figura 8J-2 79   Figura 8K-1   Figura 8K-2 81   Figura 9A 82   Figura 9B 83   84   Figura 12