Nueva cepa de Lactobacillus plantarum para la producción de carotenoides.

La presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana, CECT 7531, que pertenece a la especie Lactobacillus plantarum, o cualquier cepa mutante que proceda de la misma. La presente invención se refiere también al uso de dicha cepa para la producción de carotenoides, para la fabricación de un alimento probiótico, de un complemento nutricional, vitamínico o mineral, así como un método para la producción de carotenoides mediante dicha cepa.

Nueva cepa de Lactobacillus plantarum para la producción de carotenoides.

La presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana, CECT 7531, que pertenece a la especie Lactobacillus plantarum, o cualquier cepa mutante que proceda de la misma. La presente invención se refiere también al uso de dicha cepa para la producción de carotenoides, para la fabricación de un alimento probiótico, de un complemento nutricional, vitamínico o mineral, así como un método para la producción de carotenoides mediante dicha cepa.

Estado de la técnica anterior

Los carotenoides son un grupo de compuestos terpenoides coloreados y con propiedades antioxidantes que están muy extendidos en los reinos vegetal y animal, así como en hongos y en microorganismos fotosintéticos y no fotosintéticos. En estos últimos, aunque no son esenciales para su crecimiento como organismos heterótrofos, desempeñan importantes funciones biológicas. Así, en bacterias Gram positivas, los carotenoides juegan un papel importante protegiendo del estrés oxidativo al capturar radicales libres con sus dobles enlaces conjugados (Clauditz et al., 2006, Infection and Immunity, 74: 4950-4953). También ha sido demostrada una correlación entre la producción de carotenoides y una disminución de la fluidez de la membrana plasmática, lo que proporciona, por ejemplo, resistencia al ácido oléico en Staphylococcus aureus. Además, los carotenoides son usados comercialmente como colorantes alimentarios, suplementos de comida de animales y, más recientemente, como parte de nutracéuticos, alimentos funcionales, cosméticos y productos farmacéuticos (Lee y Schmidt-Dannert, 2002. Applied Microbiology and Biotechnology, 60: 1-11).

En la actualidad, la ingeniería metabólica de diversos microorganismos, incluyendo los no carotenogénicos, está siendo explotada para la producción biotecnológica de grandes cantidades de carotenoides razonablemente puros así como para sintetizar estructuras carotenoides novedosas usando estrategias combinatorias y de evolución in vitro (Lee y Schmidt-Dannert, 2002. Applied Microbiology and Biotechnology, 60: 1-11; Umeno et al., 2005. Journal of Bacteriology 184: 6690-6699).

Las bacterias del ácido láctico (BAL) son bacilos o cocos Gram positivos, de bajo contenido GC, microaerófilos, no esporulados, que fermentan azúcares para producir principalmente ácido láctico, y que están asociados por características fisiológicas comunes. Estas bacterias han sido históricamente asociadas con las fermentaciones de alimentos, y su importancia industrial está además evidenciada por su consideración de microorganismos generalmente seguros (Generally Regarded As Safe, GRAS, en inglés) (Holzapfel et al., 1995. International Journal of Food Microbiology, 24: 343-362). Entre las BAL, las especies seleccionadas del género Lactobacillus son ampliamente usadas como probióticos, especialmente en productos lácteos y suplementos dietéticos (Klaenhammer et al., 2005. FEMS Microbiology Reviews, 29: 393-409). Una de estas especies, Lactobacillus plantarum, es importante industrialmente, estando implicada en muchas fermentaciones de vegetales, al tiempo que es habitante natural del tracto intestinal humano (Johansson et al., 1993. Applied and Environmental Microbiology, 59: 15-20).

El uso de una cepa bacteriana que tenga la capacidad de producir cantidades de carotenoides superiores a las que son obtenidas por cepas silvestres conocidas es de especial interés para su aplicación biotecnológica.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana, la cepa CECT 7531, que pertenece a la especie Lactobacillus plantarum, o cualquier cepa mutante que proceda de la misma. La presente invención se refiere también al uso de dicha cepa para la producción de carotenoides, para la fabricación de un alimento probiótico, de un complemento nutricional, vitamínico o mineral, así como un método para la producción de carotenoides mediante dicha cepa.

En la presente invención se demuestra la presencia de biosíntesis de carotenoides C₃₀ en varias de las cepas de Lactobacillus plantarum (L. plantarum) estudiadas, especialmente en aquellas aisladas de fermentaciones de aceitunas. Una de estas cepas, la cepa CECT 7531, aislada de una fermentación de aceitunas de mesa, produjo una cantidad de carotenoides muy superior a la media (46,03 mg/kg peso seco), siendo esta producción unas dos veces y media superior a la segunda cepa mayor productora encontrada (LPT49/6, 19,18 mg/kg peso seco), lo cual supone un efecto inesperado. Además, los genes crtM y crtN, implicados en la biosíntesis del carotenoide C₃₀ 4,4'-diaponeurosporeno, están presentes en todas las cepas ensayadas.

La cepa CECT 7531 de L. plantarum de la presente invención puede ser usada para fermentar alimentos o piensos para animales. El uso de cepas seleccionadas super-productoras de carotenoides, como es el caso de la cepa de la presente invención, mejora su rendimiento en estas fermentaciones a través de un incremento de su resistencia a diferentes condiciones de estrés. Además, todo ello contribuye a incrementar la cantidad total de antioxidantes aportados en la dieta, tanto humana como animal. Debido a que L. plantarum es un reconocido habitante del tracto gastrointestinal, su uso en la dieta es de extraordinario interés ya que el microorganismo aporta una cantidad continua de moléculas antioxidantes en un lugar donde su acción protectora es muy bien recibida.

En este sentido, un aspecto de la presente invención es una cepa bacteriana, la cepa CECT 7531, que pertenece a la especie Lactobacillus plantarum, de acuerdo con los criterios moleculares definidos por Torriani et al., (2001). Applied and Environmental Microbiology, 67: 3450-3454. La cepa CECT 7531 puede ser cultivada, pero sin limitarse, en medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe, (1960). Appl. Bact., 23: 130-135), a una temperatura de 30ºC en condiciones aerobias. Las condiciones de mantenimiento de dicha cepa son, pero sin limitarse, mediante cultivos saturados añadiendo 20% glicerol y congelando a -80ºC, o mediante liofilización.

La cepa CECT 7531 de Lactobacillus plantarum procede de fermentaciones de aceitunas de mesa. Dicha cepa es capaz de producir una pigmentación amarilla de sus colonias aisladas cuando son crecidas en un medio sólido, semisólido o líquido. La pigmentación amarilla en medio líquido se demuestra al centrifugar estos cultivos y recoger los pellets de células correspondientes. Además, dicha cepa contiene los genes crtM y crtN, genes que codifican para las enzimas dehidroescualeno sintasa y dehidroescualeno desaturasa respectivamente, dos enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis de carotenoides triperpenoides (con 30 átomos de carbono).

La cepa CECT 7531 puede ser utilizada para generar una cepa mutante (cepa mutante derivada). Dicha mutación puede ser espontánea o inducida. La mutación puede llevarse a cabo por medio de la aplicación de uno o varios métodos de mutagénesis. El método se selecciona, pero sin limitarse, de la lista que comprende mutagénesis química, mutagénesis por radiaciones o mutagénesis por elementos transponibles.

Las mutaciones espontáneas pueden ocurrir debido a la acción de las radiaciones naturales e incluso durante la replicación del ADN debido a errores en la lectura de las bases. La frecuencia de mutación (la proporción de mutantes en la población) puede aumentarse significativamente con el uso de métodos de mutación inducida.

Tanto las mutaciones espontáneas como las inducidas se producen como resultado de cambios estructurales en el genoma como por ejemplo, pero sin limitarse, cambio en el número de cromosomas, cambio en el orden de uno o varios genes dentro del cromosoma o cambio en la secuencia de bases dentro de un gen (mutación puntual). La mutación puntual puede provocar la sustitución de un nucleótido por otro nucleótido o el desplazamiento de la pauta abierta de lectura (inserción o delección de uno o más nucleótidos).

El agente que provoca mutagénesis química se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, agentes que reaccionan con el ADN, agentes intercalantes o análogos de bases. El agente que reacciona con el ADN es capaz de reaccionar directamente con éste, aunque no se esté replicando, ocasionando... [Seguir leyendo]

1. Cepa bacteriana CECT 7531 de Lactobacillus plantarum.

2. Población celular que comprende células de la cepa según la reivindicación 1.

3. Uso de la cepa o de la población celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para la producción de carotenoides.

4. Uso de la cepa o de la población celular según la reivindicación 3 donde el carotenoide es un triterpenoide.

5. Uso de la cepa o de la población celular según la reivindicación 4 donde el triterpenoide es un diapocaroteno.

6. Uso de la cepa o de la población celular según la reivindicación 5 donde el diapocaroteno es 4,4'-diaponeusporeno.

7. Uso de la cepa o de la población celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para la fabricación de un alimento probiótico.

8. Uso de la cepa o de la población según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para la fabricación de un complemento nutricional.

9. Uso de la cepa o de la población según la reivindicación 8, donde el complemento nutricional es un complemento vitamínico y/o mineral.

10. Uso de la cepa o de la población celular según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde el alimento probiótico o el complemento nutricional se presenta en una forma adaptada a la administración oral.

11. Método para la producción de carotenoides que comprende: