NANOINFORMADORES Y MÉTODOS PARA SU PRODUCCIÓN Y USO.

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la detección y la cuantificación de moléculas diana individuales en muestras biomoleculares. En particular, la invención se refiere a moléculas informadoras marcadas, codificadas, referidas en la presente memoria como "nanoinformadores" marcados, que son capaces de unirse a moléculas diana individuales. A través de los códigos de marcaje de los nanoinformadores, la unión de los nanoinformadores a las moléculas diana da como resultado la identificación de las moléculas diana. También se proporcionan los métodos para elaborar y utilizar dichos nanoinformadores. Los nanoinformadores se pueden utilizar en aplicaciones de diagnóstico, pronóstico, control de calidad y escrutinio. 2.ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere generalmente al campo de la detección, identificación, y cuantificación de moléculas diana en mezclas. Aunque todas las células del organismo humano contienen el mismo material genético, los mismos genes no son activos en todas esas células. Las alteraciones en los patrones de expresión génica pueden tener profundos efectos sobre las funciones biológicas. Estas variaciones en la expresión génica se encuentran en el núcleo de de los procesos fisiológicos alterados y patológicos. Por lo tanto, la identificación y cuantificación de la expresión de los genes en células normales en comparación con las células enfermas puede ayudar al descubrimiento de nuevos fármacos y dianas diagnósticas. Los ácidos nucleicos pueden ser detectados y cuantificados basándose en sus secuencias de polinucleótidos específicas. El principio básico subyacente a los métodos existentes de detección y cuantificación es la hibridación de una secuencia sonda complementaria marcada a una secuencia diana de interés en una muestra. La formación de un dúplex indica la presencia de la secuencia diana en una muestra y el grado de formación de dúplex, medido por la cantidad de marca incorporada en él, es proporcional a la cantidad de secuencia diana. Esta técnica, denominada hibridación molecular, ha sido una herramienta útil para identificar y analizar secuencias de ácidos nucleicos específicas en mezclas complejas. Esta técnica ha sido utilizada en diagnósticos, por ejemplo, para detectar secuencias de ácido nucleico de diferentes microbios en muestras biológicas. Por añadidura, se han utilizado técnicas de hibridación para cartografiar las diferencias genéticas o los polimorfismos entre individuos. Además, se han utilizado estas técnicas para controlar los cambios en la expresión génica en diferentes poblaciones de células o en células tratadas con diferentes agentes. En el documento WO 2005/071401 se describe un método para el análisis simultáneo, en un formato homogéneo, para la detección de múltiples secuencias diana de ácido nucleico. La invención utiliza sondas de captura conjugadas con sustratos que son distinguibles basándose en la firma espectral única combinada con sondas informadoras que tienen una marca detectable por separado. En particular, los sustratos son subconjuntos de microesferas, creados impregnando una combinación de dos colorantes fluorescentes en diferentes proporciones para producir una única firma espectral para cada subconjunto. En presencia de una secuencia diana, se forman complejos detectables que son distinguibles para cada combinación de diana, sonda de captura (que portaobjetos subconjuntos de cuentas que contienen una sola firma espectral) y sonda informadora (que contiene una sola señal producida por una marca fluorescente). El documento US 6.268.147 hace referencia a un método para analizar ADN genómico y secuencias expresadas utilizando oligonucleótidos coadyuvantes, previamente recocidas con el ácido nucleico diana de hebra sencilla para formar una molécula diana parcialmente dúplex. El analito de ácido nucleico no marcado (la "secuencia diana") se desnaturaliza y se recuece o se hibrida a un exceso molar de dos o más sondas oligonucleotídicas, al menos una de las cuales está marcada, y que se unen a secuencias diana en una o más regiones de la secuencia conocida, para formar una estructura parcialmente dúplex en la que al menos dos sondas oligonucleotídicas se unen a la secuencia diana en tándem, formando una región dúplex en la que la unión de al menos una sonda es estabilizada por el apilamiento de bases contiguas ininterrumpidas con la sonda hibridante en tándem. Las sondas están marcadas simplemente con marcas o etiquetas detectables. El documento WO 03/003810 hace referencia a sondas individuales, presentes en poblaciones. En particular, este documento describe una población diversa de sondas marcadas únicamente, que contienen alrededor de treinta o más sondas de ácido nucleico específicas de la diana ancladas cada una a una marca única unida a un ácido nucleico, y los métodos de uso de estas sondas para detectar un analito de ácido nucleico. En el pasado, solamente se podían detectar unos pocos genes en una muestra compleja de una vez. En el siglo pasado, varias tecnologías han hecho posible controlar el nivel de expresión de un gran número de transcritos en el interior de una célula al mismo tiempo (véanse, p. ej., Schena et al., 1995, Science 270: 467-470; Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 1675-1680; Blanchard et al., 1996, Nature Biotechnology 14:1649). En los 2   organismos para los cuales se conoce la mayor parte o todo el genoma, es posible analizar los transcritos de un gran número de genes del interior de la célula. La mayor parte de estas tecnologías emplean micromatrices de ADN, dispositivos que consisten en miles de secuencias de ADN inmovilizadas presentes sobre una superficie miniaturizada que han hecho más eficaz este procedimiento. Utilizando una micromatriz, es posible detectar en un solo experimento la presencia o ausencia de miles de genes en una muestra biológica. Esto permite a los investigadores realizar simultáneamente varias pruebas diagnósticas en una muestra, u observar los cambios en el nivel de expresión en miles de genes en un experimento. Generalmente, las micromatrices se preparan uniendo secuencias de ADN a una superficie tal como una membrana de nailon o un portaobjetos de vidrio en localizaciones definidas precisamente sobre una rejilla. Después los ácidos nucleicos de la muestra biológica se marcan y se hibridan a la matriz. El ADN marcado de la muestra marca la posición exacta de la matriz en la que se produce la hibridación, permitiendo la detección automática. Desafortunadamente, a pesar de la miniaturización de los formatos de las matrices, este método todavía requiere cantidades significativas de la muestra biológica. Sin embargo, en algunos casos, tales como las biopsias de tejidos enfermos o las muestras de un tipo de células discreto, la muestra biológica se encuentra en una provisión limitada. Además, la cinética de la hibridación sobre la superficie de una micromatriz es menos eficaz que la hibridación en pequeñas cantidades de solución acuosa. Por otra parte, si bien existen métodos para estimar la cantidad de ácido nucleico presente en una muestra basándose en el resultado de la hibridación con la micromatriz, la tecnología de las micromatrices hasta ahora no permite la detección de moléculas diana a nivel individual, ni existen métodos basados en micromatrices para cuantificar directamente la cantidad de molécula diana en una muestra dada. De este modo, existe la necesidad de una detección, identificación y cuantificación exacta y sensible de moléculas diana en mezclas complejas. El comentario o la cita de una referencia en la presente memoria no deberán ser considerados un reconocimiento de que dicha referencia constituya técnica anterior para la presente invención. 3.COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención hace referencia a métodos para la generación de diversas poblaciones de moléculas marcadas únicamente, preferiblemente moléculas sintéticas, referidas en la presente memoria como nanoinformadores, que pueden ser utilizadas para la detección, identificación, y cuantificación directa de una amplia variedad de moléculas diana. Los métodos son ventajosos ya que generan un gran número de moléculas informadoras perfectamente marcadas, cada una capaz de detectar una única molécula diana, partiendo solo de un pequeño número de tipos diferentes de monómeros marcadores. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un nanoinformador dual, o un "par de sondas", que comprende dos componentes: una primera sonda y una segunda sonda. La primera sonda es un complejo que comprende: (a) una primera molécula, o un armazón, que comprende: (i) una primera región de anclaje a la marca a la que están unidos (directamente o indirectamente) uno o más monómeros marcadores que... [Seguir leyendo]

1. Un par de sondas que comprende una primera sonda y una segunda sonda, (a) siendo dicha primera sonda un complejo que comprende: (i) una primera molécula que comprende una primera región de anclaje a la marca a la que se anclan uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye una primera señal y una segunda región de anclaje a la marca, que no es solapante con la primera región de anclaje a la marca, a la que se anclan uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituyen una segunda señal; (ii) una primera secuencia específica de la diana anclada a la primera molécula, y (iii) una etiqueta de afinidad anclada a dicha primera molécula, (b) siendo dicha segunda sonda una segunda molécula, que comprende (i) una segunda secuencia específica de la diana; (ii) opcionalmente, una tercera región de anclaje a la marca a la que se anclan uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye una tercera señal; y (iii) una etiqueta de afinidad anclada a dicha segunda molécula; donde la primera secuencia específica de la diana y la segunda secuencia específica de la diana se unen a regiones diferentes de la misma molécula diana, donde la molécula diana es una molécula de origen natural o un ADNc de una molécula de origen natural o el complemento de dicho ADNc, donde cuando dicho par de sondas se une a su molécula diana, la identidad de la primera y segunda señales y sus localizaciones relativas entre sí constituyen al menos parte de un código que identifica la molécula diana, donde la primera, la segunda, y la tercera regiones de anclaje a la marca son secuencias de nucleótidos predeterminadas, donde la primera, la segunda, y la tercera señales son distinguibles espacialmente, y donde una primera molécula de ADN o ARN se hibrida a la primera región de anclaje a la marca, a cuya dicha primera molécula de ADN o ARN se unen dichos uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye dicha primera señal; y donde una segunda molécula de ADN o ARN se hibrida a la segunda región de anclaje a la marca, a cuya dicha segunda molécula de ADN o ARN se unen dichos uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye dicha segunda señal. 2. Un par de sondas que comprende una primera sonda y una segunda sonda, (a) siendo dicha primera sonda un complejo que comprende: (i) una primera molécula que comprende una primera región de anclaje a la marca a la que se anclan uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye una primera señal y una segunda región de anclaje a la marca, que no es solapante con la primera región de anclaje a la marca, a la que se anclan uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye una segunda señal; (ii) una primera secuencia específica de la diana anclada a la primera molécula, y (iii) una etiqueta de afinidad anclada a dicha primera molécula, (b) siendo dicha segunda sonda una segunda molécula, que comprende (i) una segunda secuencia específica de la diana; (ii) opcionalmente, una tercera región de anclaje a la marca a la que se anclan uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye una tercera señal; y (iii) una etiqueta de afinidad anclada a dicha segunda molécula; donde la primera secuencia específica de la diana y la segunda secuencia específica de la diana se unen a regiones diferentes de la misma molécula diana, 72   donde la primera señal, la segunda señal y la tercera señal son distinguibles espacialmente; donde la molécula diana es una molécula de origen natural o un ADNc de una molécula de origen natural o el complemento de dicho ADNc, donde cuando dicho par de sondas se une a su molécula diana, la identidad de la primera y segunda señales y sus localizaciones relativas entre sí constituyen al menos parte de un código que identifica la molécula diana, donde la primera, la segunda, y la tercera regiones de anclaje a la marca son secuencias de nucleótidos predeterminadas, y donde una primera molécula de ADN o ARN se hibrida a la primera región de anclaje a la marca, a cuya dicha primera molécula de ADN o ARN se unen dichos uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye dicha primera señal; y donde una segunda molécula de ADN o ARN se hibrida a la segunda región de anclaje a la marca, a cuya dicha segunda molécula de ADN o ARN se unen dichos uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye dicha segunda señal. 3. El par de sondas de las reivindicaciones 1 o 2, donde se hibridan una pluralidad de primeras moléculas de ADN o ARN a la primera región de anclaje a la marca, a cuyas moléculas de ADN o ARN se unen dichos uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye dicha primera señal; y donde una pluralidad de segundas moléculas de ADN o ARN se hibridan a la segunda región de anclaje a la marca, a cuyas segundas moléculas de ADN o ARN se unen dichos uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye dicha segunda señal. 4. El par de sondas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la segunda sonda comprende una tercera región de anclaje a la marca a la que se anclan uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye una tercera señal. 5. El par de sondas de la reivindicación 4, donde dicha tercera región de anclaje es una secuencia de nucleótidos predeterminada, y donde una tercera molécula de ARN se hibrida a la tercera región de anclaje a la marca, a cuya tercera molécula de ARN se anclan dichos uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye dicha tercera señal. 6. El par de sondas de la reivindicación 5, donde cuando el par de sondas se une a su molécula diana, el código comprende la identidad de la primera señal, la segunda señal y la tercera señal y sus localizaciones relativas entre sí. 7. El par de sondas de las reivindicaciones 1 o 2, donde el código comprende la identidad de la primera y segunda señales, sus localizaciones relativas entre sí, y el tamaño de la mancha resultante de al menos una de dichas señales. 8. El par de sondas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la primera y la segunda moléculas son moléculas de ácido nucleico. 9. El par de sondas de la reivindicación 8, donde las regiones de anclaje a la marca y las secuencias específicas de la diana son secuencias de nucleótidos predeterminadas. 10. El par de sondas de la reivindicación 9, en el que dichos uno o más monómeros marcadores se anclan covalentemente a los ácidos nucleicos hibridados a sus respectivas regiones de anclaje. 11. El par de sondas de la reivindicación 10, donde dichos ácidos nucleicos se hibridan a las respectivas regiones de anclaje por medio de uno o más ácidos nucleicos que forman puentes unidos no covalentemente. 12. El par de sondas de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la primera y la segunda secuencias específicas de la diana no están marcadas con uno o más cualesquiera de dichos monómeros marcadores. 13. El par de sondas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la segunda molécula comprende adicionalmente una cuarta región de anclaje a la marca, que no se solapa con la tercera región de anclaje a la marca, a la que se anclan uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye una cuarta señal. 14. El par de sondas de la reivindicación 13, donde cuando el par de sondas se une a su molécula diana, el código comprende la identidad de la primera señal, la segunda señal, la tercera señal y la cuarta señal y sus localizaciones relativas entre sí. 15. El par de sondas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde una primera molécula de ARN se hibrida a la primera región de anclaje a la marca, a cuya primera molécula de ARN se unen dichos uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituyen dicha primera señal; y donde una segunda molécula de ARN se hibrida a la segunda región de anclaje a la marca, a cuya segunda molécula de ARN se unen dichos uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituyen dicha segunda señal. 73   16. El par de sondas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde las etiquetas de afinidad se anclan covalentemente a la primera molécula o a la segunda molécula. 17. El par de sondas de las reivindicaciones 1 o 2, donde los monómeros marcadores anclados a la primera región de anclaje a la marca emiten luz a la misma longitud de onda, cuya luz constituye dicha primera señal, donde los monómeros marcadores anclados a la segunda región de anclaje a la marca emiten luz a la misma longitud de onda, cuya luz constituye la segunda señal y donde los monómeros marcadores anclados a la tercera región de anclaje a la marca, si estuvieran presentes, emiten luz a la misma longitud de onda, cuya luz constituye la tercera señal. 18. El par de sondas de las reivindicaciones 1 o 2, donde al menos una de la primera señal y la segunda señal comprende luz a una pluralidad de diferentes longitudes de onda. 19. El par de sondas de las reivindicaciones 1 o 2, donde la primera, la segunda y la tercera señales son espectralmente distinguibles. 20. El par de sondas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la primera y la segunda moléculas de ARN tienen cada una de 100 a 3.000 nucleótidos de longitud o donde la primera y la segunda moléculas de ARN tienen cada una de 500 a 1.500 nucleótidos de longitud. 21. El par de sondas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la segunda sonda es un complejo de ácido nucleico que comprende: (a) la segunda molécula, donde la segunda molécula comprende una tercera región de anclaje a la marca a la cual se hibrida una tercera molécula de ARN, a cuya tercera molécula de ARN se unen uno o más monómeros marcadores que emiten luz que constituye una tercera señal; y (b) la segunda secuencia específica de la diana anclada a la segunda molécula, donde el código comprende la identidad de la primera, la segunda y la tercera señales y sus localizaciones relativas entre sí. 22. El par de sondas de la reivindicación 21, donde los monómeros marcadores anclados a la primera región de anclaje a la marca emiten luz a la misma longitud de onda, cuya luz constituye dicha primera señal; donde los monómeros marcadores anclados a la segunda región de anclaje a la marca emiten luz a la misma longitud de onda, cuya luz constituye la segunda señal; y donde los monómeros marcadores anclados a la tercera región de anclaje a la marca emiten luz a la misma longitud de onda, cuya luz constituye la tercera señal. 23. El par de sondas de la reivindicación 21, donde al menos una de la primera señal, la segunda señal y la tercera señal comprende luz a una pluralidad de diferentes longitudes de onda. 24. El par de sondas de la reivindicación 21, en el que la primera secuencia específica de la diana y la segunda secuencia específica de la diana no están marcadas con uno cualquiera o más de dichos monómeros marcadores. 25. El par de sondas de la reivindicación 21, donde la primera, la segunda y la tercera señales son distinguibles espectralmente. 26. El par de sondas de la reivindicación 21, donde la primera y la tercera señales emiten a la misma o a las mismas longitudes de onda. 27. El par de sondas de la reivindicación 21, donde la etiqueta de afinidad se une covalentemente a la primera molécula. 28. El par de sondas de la reivindicación 21, donde la etiqueta de afinidad se une covalentemente a la segunda molécula. 29. El par de sondas de la reivindicación 21, donde la primera, la segunda y la tercera moléculas de ARN tienen cada una de 100 a 3.000 nucleótidos o donde la primera, la segunda y la tercera moléculas de ARN tienen cada una de 500 a 1.500 nucleótidos, 30. El par de sondas de las reivindicaciones 21-30, donde las moléculas de ARN comprenden una única región que comprende una base repetida regularmente. 31. El par de sondas de la reivindicación 30, donde la base repetida regularmente es uracilo modificado con aminoalilo. 32. Un método para la detección de una molécula diana en una muestra biomolecular que comprende: (i) poner en contacto dicha muestra con un par de sondas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-31 en condiciones que permitan la unión de la primera secuencia específica de la diana y la segunda secuencia específica de la diana a la molécula diana y 74   (ii) detectar el código que identifica la molécula diana. 33. El método de la reivindicación 32, que comprende adicionalmente la cuantificación de la cantidad de dicha molécula diana en dicha muestra biomolecular. 34. El método de las reivindicaciones 32 o 33, donde la concentración de cada una de dichas primera y segunda secuencias específicas de la diana está en exceso de la concentración de dicha molécula diana. 35. El método de las reivindicaciones 32-34, que comprende adicionalmente la etapa de estiramiento del par de sondas unido y la molécula diana antes de la detección del código que identifica la molécula diana. 36. El método de la reivindicación 35, donde el estiramiento se realiza utilizando una técnica seleccionada del grupo que consiste en estiramiento por flujo, una técnica de menisco en retracción, electroestiramiento y constricción en el flujo de un líquido que contiene el nanoinformador junto con un campo eléctrico oscilante. 37. Un método de detección de una pluralidad de moléculas diana en una muestra biomolecular que comprende: (i) poner en contacto dicha muestra con una población de pares de sondas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-31, en condiciones que permitan la unión de la primera secuencia específica de la diana y la segunda secuencia específica de la diana de cada par de sondas a su molécula diana respectiva, donde cada par de sondas en dicha población cuando se une a su molécula diana respectiva está asociada a un código distinguible, y (ii) detectar los códigos que identifican la pluralidad de moléculas diana. 38. El método de la reivindicación 37, que comprende adicionalmente cuantificar la cantidad de cada una de dicha pluralidad de moléculas diana en dicha muestra biomolecular. 39. El método de las reivindicaciones 37-38, donde la concentración de cada una de dichas primera y segunda secuencias específicas de la diana de cada par de sondas de dicha población está en exceso de la concentración de su molécula diana respectiva. 40. El método de las reivindicaciones 37-39, que comprende adicionalmente la etapa de estiramiento de los pares de sondas unidos y sus moléculas diana respectivas antes de detectar los códigos que identifican la pluralidad de moléculas diana. 41. El método de la reivindicación 40, donde el estiramiento se realiza utilizando una técnica seleccionada del grupo que consiste en estiramiento por flujo, una técnica de menisco en retracción, electroestiramiento y constricción en el flujo de un líquido que contiene el nanoinformador junto con un campo eléctrico oscilante.   76   77   78   79     81   82   83   84     86   87   88   89     91   92   93   94     96   97   98