Moléculas bloqueadoras de la fluorescencia así como los métodos y utilizaciones que las implican.

Un compuesto de fórmula I **Fórmula**

en el que

uno de R1 y R2 es hidrógeno,

alquilo C1-C6 o un halógeno,

y el otro es -Q-Y, en el que Q es una cadena de hidrocarburo C1-C10 recta o ramificada, saturada o insaturada,sustituida o sin sustituir y Y se selecciona de entre el grupo que consiste en hidroxilo, carboxilo, y amino; yR3 y R4 están representados independientemente el uno del otro por -NR5R6, en el que R5 y R6 sonindependientemente el uno del otro hidrógeno o arilo sustituido o sin sustituir.

Moléculas bloqueadoras de la fluorescencia así como los métodos y utilizaciones que las implican

La presente invención esta relacionada con nuevos derivados de piridinil-isoquinolina-diona, métodos para producir estos derivados, conjugados que comprenden a los nuevos derivados de piridinil-isoquinolina-diona y (i) un soporte sólido, o (ii) una biomolécula, métodos para producir estos conjugados así como el uso de estos conjugados como bloqueadores en la transferencia de energía por resonancia de la fluorescencia (FRET) .

La transferencia de energía por resonancia de la fluorescencia (abreviado FRET) , también conocida como transferencia de energía por resonancia Förster (en honor a su descubridor Theodor Förster) es un mecanismo que describe la transferencia de la energía de excitación de una molécula a otra sin la necesidad de fluorescencia y reabsorción. De acuerdo con Förster, la transferencia de energía procedente a través del acoplamiento dipolo-dipolo de los dipolos de fluorescencia donadores con los dipolos de absorción aceptores. Así, el fenómeno de FRET es siempre una transferencia de energía no radiactiva. Un cromóforo donador, inicialmente en su estado electrónicamente excitado tras haber absorbido luz de una determinada longitud de onda puede transferir energía sin radiación a un aceptor, después de lo cual el aceptor se promueve a su estado electrónicamente excitado. Posteriormente, el estado electrónicamente excitado del aceptor se desintegra de forma que a su vez emite energía. La eficiencia de FRET depende de muchos parámetros que pueden agruparse como sigue: la distancia entre el donador y el aceptor; el solapamiento espectral del espectro de emisión del donador y el espectro de absorción del aceptor; y la orientación relativa del momento de emisión del dipolo donador y el momento de absorción del dipolo aceptor.

En la tecnología convencional FRET el donador y el aceptor son ambos fluoróforos. En consecuencia, la energía absorbida por un fluoróforo donador como luz de una cierta longitud de onda (absorción de longitud de onda) se transfiere al aceptor. Mediante la absorción de la energía transferida el aceptor se promueve a un estado electrónicamente excitado que posteriormente desaparece mientras que la energía transferida al aceptor emite luz de una longitud de onda particular (emisión de longitud de onda) . La longitud de onda de emisión cambia a una longitud de onda más larga en comparación con la longitud de onda de absorción. Cuando el donador y el aceptor están muy cercanos (por ejemplo, 1-10 nm) debido a la interacción de los cromóforos, la emisión del aceptor se observa de forma predominante debido a la FRET desde el donador al aceptor.

En consecuencia, el fenómeno de la FRET puede detectarse mediante un descenso en la fluorescencia del donador

o un aumento en la fluorescencia del aceptor.

En una forma específica de FRET un bloqueador se aplica en lugar de un aceptor fluorescente (J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence, 2ª edición, Kluwer Academic Plenum Publishers, NewYork, 1999) . Un bloqueador es una molécula que absorbe la energía transferida desde el donador (también denominado marcador) pero en lugar de emitir luz bloquea la fluorescencia. En consecuencia, en un sistema marcador-bloqueador, el donador transfiere la energía al bloqueador. Por lo tanto, el donador vuelve a su estado inicial y genera el estado excitado del bloqueador. Posteriormente, el estado excitado del bloqueador desaparece de forma no radiactiva (bloqueador oscuro) . En una desintegración no radiactiva o desintegración oscura, la energía se desprende mediante vibraciones moleculares (calor) . Ya que la concentración de bloqueadores en una sonda está normalmente en el rango de !M o inferior, el calor desintegración no radiactiva es demasiado pequeña para afectar a la temperatura de la solución. De acuerdo con la ecuación de Förster dicho bloqueo de la fluorescencia también depende de la distancia entre el donador y el aceptor. Al contrario que en la técnica FRET mencionada anteriormente, se mide solo la emisión del donador y no la del aceptor: cuantos más cromóforos se separan los unos de los otros, más débil es la transferencia de energía por lo que la fluorescencia del donador aumenta correspondientemente.

Hasta estos últimos años, los bloqueadores han sido normalmente colorantes fluorescentes, por ejemplo, fluoresceína como marcador y rodamina como bloqueador (sondas FAM/TAMRA) . Uno de los bloqueadores mejor conocidos es TAMRA (tetrametilrodamina) que se utiliza para disminuir la emisión del colorante marcador. Debido a sus propiedades TAMRA es adecuado como bloqueador para FAM (carboxifluoresceína) , HEX (hexaclorofluoresceína) , TET (tetracloro-fluoresceína) , JOE (5’-Dicloro-dimetoxifluoresceína) y colorantes Cy3 (cianina) .

La utilidad de TAMRA, sin embargo, es limitada debido a su amplio espectro de emisión que reduce sus capacidades en multiplexeado (cuando dos o más sondas marcador-bloqueador se utilizan a la vez) . Su fluorescencia intrínseca contribuye a la señal de fondo que conduce a una disminución en la dinámica de la señal y así, reduce potencialmente la sensibilidad de los ensayos basados en TAMRA.

Los bloqueadores oscuros ofrecen una solución a este problema porque no ocupan una banda de emisión. Además, los bloqueadores oscuros permiten el multiplexeado. Un bloqueador oscuro típico es DABCILO (ácido 4-[4 (dimetilamino) -fenil]-azo]-benzoico) que se utiliza a menudo en combinación con balizas moleculares. DABCILO bloquea colorantes en un rango desde 380 a 530 nm. En consecuencia, incluso los fluoróforos con una emisión de longitud de onda más larga como los colorantes Cy3 pueden bloquearse mejor con DABCILO. No obstante,

DABCILO posee una banda de absorción inadecuada que se solapa muy poco con los fluoróforos que emiten por encima de los 480 nm. Otro colorante no fluorescente es el bloqueador Eclipse® (4-[[2-cloro-4-nitro-fenil]-azo]anilina, una marca de Epoch Biosciences, Inc., Corporationn Delaware 21720, 23rd Drive NE, Suite 150, Bothell Washington 98021, EEUU) que posee un máximo de absorción a 530 nm y bloquea de forma eficiente en un espectro desde 520 a 670 nm.

Una mejora sobre los bloqueadores oscuros mencionados anteriormente son los bloqueadores de agujero negro, como el BHQ-1 ([ (4- (2-nitro-4-metil-fenil) -azo) -il- ( (2-metoxi-5-metil-fenil) -azo) ]-anilina) y BHQ-2 ([ (4- (1-nitro-fenil) azo) -il- ( (2, 5-dimetoxi-fenil) -azo) ]-anilina) (todos disponibles en Biosearch Technologies, Inc.) que son capaces de bloquear a lo largo de todo el espectro visible. Estos aceptores no fluorescentes se aplican a menudo como alternativa a los aceptores fluorescentes para poder disminuir la fluorescencia de fondo y de esta manera la sensibilidad.

La desventaja de los bloqueadores no fluorescentes conocidos es, no obstante, su comportamiento de bloqueo insuficiente que resulta en un gran ruido de fondo que a su vez conduce a una dinámica de señal limitada.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar nuevos bloqueadores, preferiblemente con una señal de fondo baja y/o una eficiencia de bloqueo alta. Adicionalmente, en una realización preferible pueden acoplarse a biomoléculas o un soporte sólido para FRET.

Sorprendentemente, se ha encontrado que los derivados de piridinil-isoquinolina-diona presentan una señal de fondo baja y/o una eficiencia de bloqueo alta. Hasta ahora, esta clase de sustancias se ha descrito muy poco y solo para aplicaciones farmacéuticas (J. Med. Chem. 1991, 34, 1871-1879) . Además, los derivados de difenilamino de esta clase de sustancias y derivados con grupos funcionales para acoplar a biomoléculas o un soporte sólido no son conocidos en la técnica.

En consecuencia, la presente invención esta relacionada con un compuesto para la fórmula I

en el que uno de R1 yR2 es hidrógeno, alquilo C1-C6 o un halógeno, y el otro es -Q-Y, en el que Q es una cadena de hidrocarburo C1-C10 recta o ramificada, saturada o insaturada , sustituida o sin sustituir y Y se selecciona de entre el grupo que consiste en hidroxilo, carboxilo, y amino; y R3 yR4 están representados independientemente el uno del otro por -NR5R6, en el que R5 yR6 son independientemente el uno del otro hidrógeno o arilo sustituido o sin sustituir.

El término "alquilo" se utiliza aquí como lo conoce el experto en la materia y se refiere a un residuo univalente que consiste en tan solo... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de fórmula I

en el que uno de R1 yR2 es hidrógeno, alquilo C1-C6 o un halógeno, y el otro es -Q-Y, en el que Q es una cadena de hidrocarburo C1-C10 recta o ramificada, saturada o insaturada, sustituida o sin sustituir y Y se selecciona de entre el grupo que consiste en hidroxilo, carboxilo, y amino; y R3 yR4 están representados independientemente el uno del otro por -NR5R6, en el que R5 yR6 son

independientemente el uno del otro hidrógeno o arilo sustituido o sin sustituir.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en la que Q es una cadena de hidrocarburo C2-C8 recta o ramificada, saturada o insaturada, sustituida o sin sustituir.

15 3. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, en la que Y es un grupo hidroxilo o carboxilo.

4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que R3 y/o R4 es/son -NR5H.

5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que cada uno de R3 yR4 es -NR5R6.

6. El compuesto de la reivindicación 5, en la que R5 es arilo sustituido o sin sustituir.

7. El compuesto de la reivindicación 5 o 6, en la que el arilo sustituido o sin sustituir es fenilo o toluilo.

25 8. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que arilo es un residuo de hidrocarbono aromático C6H5, C10H7, o C14H9.

9. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que uno de R1 yR2 es un residuo 1-hidroxi-4-etil

butilo o un residuo de ácido n-pentanoico y el otro es hidrógeno; y R5 es un residuo de 4-toluilo o un residuo de 30 fenilo.

10. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que Y is capaz de unirse a (i) un soporte sólido; o

(ii) una biomolécula. 35 11. Un método para producir un compuesto de fórmula II

dicho método comprende los pasos de:

a) reaccionar una diamida de ácido oxálico disustituida de fórmula R5-N=C (OH) -C (OH) =N-R5’ con pentacloruro de fósforo para obtener un cloruro de bis-imidoilo de ácido oxálico con la fórmula R5-N=CCl-ClC=N-R5’;

b) reaccionar el cloruro de bis-imidoilo del ácido oxálico obtenido en el paso a) con 2-amino metilpiridina para obtener una pirido[1, 2-a]pirazina disustituida de fórmula III

c) hacer reaccionar la pirido[1, 2-a]pirazina disustituida obtenida en el paso b) con una quinona mono-sustituida de fórmula IV

para obtener el compuesto de fórmula II,

en el que R1, R2, R5 son como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 7, 9 y 10, y en el que R5’se define como R5 en las reivindicaciones 1, 3 a 7, 9 y 10.

12. Un conjugado que comprende el compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y (i) un soporte sólido o (ii) una biomolécula, en la que el compuesto está acoplado al soporte o la biomolécula mediante el grupo de unión Q.

13. Un método para producir el conjugado de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende la unión de un 20 compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 a (i) un soporte sólido o (ii) una biomolécula.

14. La utilización del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o del conjugado de acuerdo con la reivindicación 12 como un bloqueador de un donador fluorescente.

15. La utilización de la reivindicación 14, en la que el conjugado se utiliza como bloqueador en la transferencia de energía por resonancia de la fluorescencia (FRET) .