Métodos para determinar un régimen quimioterapéutico basado en la pérdida de heterocigosidad en el locus de timidilato sintasa.

Método para predecir una respuesta de un paciente con cáncer a un régimen quimioterapéutico,

en el que el régimen comprende un inhibidor de timidilato sintasa (TS) , comprendiendo dicho método:

(a) determinar el genotipo del polimorfismo de repetición en tándem en la región potenciadora del gen de TS (TSER) en el tejido normal del paciente;

(b) determinar dicho genotipo en el tejido tumoral del paciente;

(c) comparar el genotipo de tejido normal con el genotipo de tejido tumoral para determinar si se ha producido en el tejido tumoral una pérdida de heterocigosidad en la TSER; y

(d) si hay una pérdida de heterocigosidad, predecir una respuesta al régimen quimioterapéutico basándose en la pérdida de heterocigosidad en la muestra tumoral, en el que

(i) una determinación de la presencia de un alelo con repetición triple en TSER (3R) predice un efecto negativo directo sobre la respuesta del tumor al régimen quimioterapéutico;

(ii) una determinación de la pérdida de heterocigosidad de 2R/3R en tejido normal a 2R/perdida en tejido tumoral predice una mayor sensibilidad del tumor al régimen quimioterapéutico con respecto a la sensibilidad de un tumor que tiene un genotipo 2R/3R; y/o

(iii) una determinación de la pérdida de heterocigosidad de 2R/3R en tejido normal a 3R/perdida en tejido tumoral predice una sensibilidad del tumor al régimen quimioterapéutico similar a la de un tumor que tiene un genotipo 3R/3R.

Métodos para determinar un régimen quimioterapéutico basado en la pérdida de heterocigosidad en el locus de timidilato sintasa.

Antecedentes de la invención La timidilato sintasa (TS) cataliza la metilación reductora de 2'-desoxiuridilato 5, 10-metilentetrahidrofolato para formar 2'-timidilato y dihidrofolato. Esto es una etapa esencial en la biosíntesis de ADN. Puesto que TS es la única fuente de novo de la base timidina, y su reacción es una de las etapas limitantes de la velocidad en la síntesis de ADN, la inhibición de TS ha sido un enfoque beneficioso en la quimioterapia contra el cáncer (Danenberg, P.V., Biochim. Biophys. Acta, 473: 73-92, 1977) . TS es la enzima diana para 5-fluorouracilo (5-FU) , que durante casi 50 años ha sido uno de los fármacos de soporte para el tratamiento de muchos cánceres. 5-FU ejerce su efecto citotóxico a través de la inhibición de TS formando un complejo ternario estable entre 5, 10-metilentetrahidrofolato, TS y 5-fluoro-2'-desoxiuridilato, el metabolito activo de 5-FU. Desde la aparición de 5-FU, se han desarrollado otras terapias a base de fluoropirimidinas tales como FUdR, UFT, S-1 y capecitabina, así como inhibidores de TS a base de folato, tales como ratitrexed, pemetrexed y nolatrexed. Los estudios in vitro han demostrado que las células se hacen resistentes a inhibidores de TS aumentando la expresión de TS y elevando los niveles intracelulares de TS (Wang, W., et al., Cancer Res., 61: 55055510, 2001) , conduciendo a la suposición de que la cantidad de TS en tumores puede ser un predictor de la respuesta de la terapia dirigida por TS. De hecho, estudios recientes han demostrado que la expresión de TS varía considerablemente entre tumores, y que la sensibilidad de diversos tumores a quimioterapia a base de 5-FU está correlacionada con el nivel intratumoral de TS (Huang, C.L., et al., Int.

J. Oncol., 17: 47-54, 2000; Nishimura, R., et al., Anticancer Res., 19: 5621-5626, 1999; Salonga, D., et al., Clin. Cancer Res., 6: 1322-1327, 2000; Shirota, Y., et al., J. Clin. Oncol., 19: 4298-4304, 2001; Yeh, K.H., et al., Cancer, 82: 1626-1631, 1998) . Además, también se ha demostrado que los niveles elevados de TS en tumores están asociados con un peor pronóstico (Kralovanszky, J., et al., Oncology, 62: 167174, 2002; Nakagawa, T., et al., Lung Cancer, 35: 165-70, 2002) .

El mecanismo mediante el cual está regulada in vivo la expresión de TS no se ha definido aún claramente. Sin embargo, se ha sugerido que los polimorfismos que aparecen en el promotor de TS pueden constituir un factor regulador. Se sabe que el gen de TS tiene una única secuencia repetida en tándem de 28 pares de bases en la región no traducida de 5' (5'-UTR) , y es polimórfica en los números de esta repetición (Horie, N., et al., Cell Struct. Funct., 20:191-197, 1995) . La mayoría de los individuos tienen un genotipo de repetición en tándem doble (2R/2R) , repetición triple (3R/3R) o un genotipo heterocigoto (2R/3R) , aunque en unos pocos casos se encuentran repeticiones de mayor orden (Marsh, S., et al., Genomics, 58: 310-312, 1999) . El polimorfismo de la región potenciadora de TS (TSER) es un determinante parcial de la expresión de la proteína de TS en cánceres gastrointestinales humanos (Kawakami, K., et al., Anticancer Res., 19: 3249-3252, 1999) , referencia la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

El tejido de cáncer con genotipo 3R/3R ha mostrado una expresión de proteína de TS significativamente mayor que aquella con el genotipo 2R/3R, que se ha confirmado con experimentos in vitro (Kawakami, K., et al., Clin. Cancer Res., 7: 4096-4101, 2001) , referencia la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Esta asociación entre el genotipo de TS y la expresión de TS, junto con el papel de la expresión de TS en una quimioterapia a base de 5-FU, sugiere que el genotipo de TS con respecto al número de repeticiones en tándem puede ser al menos un predictor parcial para la quimioterapia a base de 5-FU. De hecho, varios estudios clínicos correlativos recientes han obtenido pruebas preliminares de que el genotipo de TS de esta TSER está asociado con la respuesta y supervivencia de pacientes con cáncer colorrectal tratados con terapias a base de 5-FU (Iacopetta, B., et al., Br. J. Cancer, 85: 827-830, 2001; Marsh, S., et al., Int. J. Oncol., 19: 383-386, 2001; Pullarkat, S. et al., Pharmacogenomics J., 1, 65-70, 2001; Villafranca, E., et al., J. Clin. Oncol., 19: 1779-1786, 2001) .

La presencia de números variables de una secuencia de repetición en tándem de 28 pares de bases en la TSER ha atraído recientemente un considerable interés debido a que ésta es la única lesión genómica, aparte de la mutación p53, que puede predecir en cierto grado el resultado clínico de pacientes tratados con terapia a base de 5-FU. Todos los estudios hechos hasta la fecha están de acuerdo en que la posesión del genotipo 2R/2R se ha asociado consistentemente con un beneficio clínico mayor que el genotipo 3R/3R en pacientes tratados con 5-FU (Iacopetta, B., et al., Br. J. Cancer, 85: 827-830, 2001; Pullarkat, S. T. et al., Pharmacogenomics J., 1, 65-70, 2001; Villafranca, E., et al., J. Clin. Oncol., 19: 1779-1786, 2001; Etienne MC, et al., J. Clin. Oncol. 20:2832-43, 2002) . El descubrimiento de polimorfismos de TS que pueden ser determinantes de la respuesta tumoral fue de considerable interés debido a la posibilidad de que se pudiera hacer la predicción de la respuesta tumoral mediante análisis de tejido normal fácilmente disponible (por ejemplo, células de sangre periférica) . Esta expectativa se basa en la suposición de que el genoma en el tejido normal sería idéntico a aquel en tejido canceroso. Sin embargo, pruebas recientemente obtenidas demuestran que esta suposición no siempre es verdad en el caso del genotipo de TS. Se ha observado una incidencia elevada de LOH en el locus de TS en tejidos cancerosos, que conduce a la modificación del genotipo de TS en el tumor cuando es heterocigoto en el tejido normal (Kawakami K, et al., Jpn J Cancer Res. 93: 1221-1128, 2002; Zinzindohoue F, el al., J. Clin. Oncol. 19:3442, 2001) . Esto es, la aparición de LOH en individuos que tienen un genotipo heterocigoto 2R/3R en su tejido normal daría lugar a un tumor con un

genotipo de TSER 2R/perdida o el 3R/perdida. De este modo, es posible que pacientes que son heterocigotos y que tienen LOH en el locus de TS en su tejido tumoral puedan experimentar resultados considerablemente diferentes de la quimioterapia, dependiendo de qué alelo se suprimió durante el suceso de LOH.

Basilion et al, Molecular Pharmacology, vol. 56, no.2, 1999, p. 359-369 describen el exterminio selectivo de células cancerosas basándose en LOH que se produce durante la oncogénesis.

De este modo, todavía existe la necesidad de un método para predecir una respuesta a diversos regímenes quimioterapéuticos antes del tratamiento. Una predicción exacta permitiría a un médico determinar si continuar con un régimen quimioterapéutico deseado o intentar un régimen quimioterapéutico alternativo. Puesto que los efectos secundarios adversos son predominantes con la mayoría de los regímenes quimioterapéuticos, es deseable ser capaz de predecir la respuesta tumoral al agente quimioterapéutico para eliminar cualquier tratamiento innecesario o sin éxito. Además, si un médico es capaz de predecir la respuesta a un tratamiento, no se perderá tiempo en aquellos tratamientos que probablemente fracasarán, y en su lugar permitirá al médico centrarse en tratamientos más prometedores. Un método para predecir una respuesta al tratamiento proporciona a un médico las directrices a la hora de elegir la terapia, en lugar de un enfoque simple de ensayo y error.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para predecir una respuesta a un régimen quimioterapéutico basándose en la pérdida de heterocigosidad en el locus del timidilato sintasa en tejido canceroso. Este método comprende determinar el genotipo de tejido normal para timidilato sintasa de un paciente; determinar el genotipo del tejido tumoral para timidilato sintasa de dicho paciente; comparar el genotipo de tejido normal con el genotipo de tejido tumoral; determinar si se ha producido una pérdida de heterocigosidad en el locus de timidilato sintasa en el tejido tumoral basándose en la comparación de los genotipos; y predecir una respuesta al régimen quimioterapéutico basándose en la pérdida de heterocigosidad en la muestra tumoral.

La presente invención también contempla utilizar el genotipo del tejido normal para ayudar a predecir la respuesta del paciente... [Seguir leyendo]

1. Método para predecir una respuesta de un paciente con cáncer a un régimen quimioterapéutico, en el que el régimen comprende un inhibidor de timidilato sintasa (TS) , comprendiendo dicho método:

(a) determinar el genotipo del polimorfismo de repetición en tándem en la región potenciadora del gen de TS (TSER) en el tejido normal del paciente;

(b) determinar dicho genotipo en el tejido tumoral del paciente;

(c) comparar el genotipo de tejido normal con el genotipo de tejido tumoral para determinar si se ha producido en el tejido tumoral una pérdida de heterocigosidad en la TSER; y

(d) si hay una pérdida de heterocigosidad, predecir una respuesta al régimen quimioterapéutico basándose en la pérdida de heterocigosidad en la muestra tumoral, en el que

(i) una determinación de la presencia de un alelo con repetición triple en TSER (3R) predice un efecto negativo directo sobre la respuesta del tumor al régimen quimioterapéutico;

(ii) una determinación de la pérdida de heterocigosidad de 2R/3R en tejido normal a 2R/perdida en tejido tumoral predice una mayor sensibilidad del tumor al régimen quimioterapéutico con respecto a la sensibilidad de un tumor que tiene un genotipo 2R/3R; y/o

(iii) una determinación de la pérdida de heterocigosidad de 2R/3R en tejido normal a 3R/perdida en tejido tumoral predice una sensibilidad del tumor al régimen quimioterapéutico similar a la de un tumor que tiene un genotipo 3R/3R.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el tejido tumoral es tejido embebido en parafina fijado en formalina (FPE) .

3. Método según la reivindicación 2, que comprende además someter el tejido tumoral FPE a microdisección por captura con láser.

4. Método según la reivindicación 1, que comprende además medir los niveles de expresión del gen de TS en el tejido tumoral.

5. Método según la reivindicación 4, que comprende además

(a) determinar los niveles de la expresión del gen de TS en células tumorales de pacientes respondedores, teniendo dichos pacientes respondedores tumores que responden al régimen quimioterapéutico;

(b) determinar los niveles de la expresión del gen de TS en células tumorales de pacientes no respondedores, teniendo dichos pacientes no respondedores tumores que no muestran respuesta al régimen quimioterapéutico;

(c) comparar los niveles de la expresión del gen de TS en tejido tumoral de dicho paciente con niveles de expresión del gen de TS de pacientes respondedores y no respondedores; y

(d) predecir una respuesta al régimen quimioterapéutico basándose en la comparación de la etapa (c) .

6. Método según la reivindicación 1, en el que el régimen quimioterapéutico comprende la administración de 5-FU, FUdR, UFT, S-1, capecitabina, ratitrexed, pemetrexed, o nolatrexed, o una combinación de los mismos.

7. Método según la reivindicación 6, en el que el régimen quimioterapéutico comprende la administración de 5-FU, FUdR, UFT, S-1, capecitabina, ratitrexed, pemetrexed, o nolatrexed, en combinación con cisplatino, oxaliplatino, un taxano, o radiación.

8. Método según la reivindicación 1, que comprende además

(a) identificar otros pacientes que tienen un genotipo de tejido normal que es el mismo que el genotipo de tejido normal del paciente con cáncer;

(b) calcular los niveles de toxicidad farmacéutica en dichos otros pacientes después del tratamiento con el régimen quimioterapéutico; y

(c) correlacionar dichos niveles de toxicidad farmacéutica con el paciente con cáncer, para predecir la respuesta del paciente al régimen quimioterapéutico.