método de evaluación de la composición de un cultivo celular, comprendiendo el método lo siguiente:

a) obtener un conjunto de células diversas de un cultivo celular;

b) determinar el nivel de expresión promedio de un marcador fibroblástico en un conjunto diverso de células entre las que el citado marcador fibroblástico es la proteína microfibrilar asociada 5 (MFAP5); y

c) determinar la composición del cultivo basándose en el nivel de expresión promedio de la proteína microfibrilar 5 asociada (MFAP5); donde el nivel de expresión medio de MFAP5 por debajo de un determinado umbral indica que el cultivo celular incluye condrocitos.

Métodos de evaluación de células y cultivos celulares

Esta solicitud reivindica la prioridad sobre la solicitud provisional 60/910, 574 presentada el 6 de abril de 2007.

Esta invención guarda relación con los métodos de determinación de la composición de un cultivo celular, y más concretamente, con métodos para diferenciar los condrocitos de los fibroblastos.

Las lesiones del cartílago articular presentan bajas tasas de reparación, debido en parte a la falta de aporte sanguíneo en el tejido cartilaginoso (Basad y cols., En: Hendrich y cols., Cartilage Surger y and Future Perspectives, Thieme Verlag, 49-56 (2003) ) . El traumatismo de la articulación de la rodilla puede producir, por ejemplo, lesiones condrales y osteocondrales, y, dichas lesiones pueden evolucionar a osteoartritis (Brittberg y cols., New England Journal of Medicine, 331 (14) : 889-895 (1994) ) . En casos graves de osteoartritis, puede ser necesaria la artroplastia total de rodilla. Sin embargo, las prótesis artificiales usadas en las artroplastias de rodilla tienen ciclos de vida útil limitados, por lo que las artroplastias de rodilla no constituyen soluciones idóneas, especialmente en pacientes de edad no avanzada (Brittberg y cols., supra) .

En algunos casos, las lesiones del cartílago articular pueden repararse mediante el implante de condrocitos autólogos (Brittberg y cols., Clin. Orthopaed. Rel. Res., 367S: S147-S155 (1999) ) . En esta intervención, se recogen condrocitos de un paciente, se expanden en un cultivo celular para aumentar el número de condrocitos y, posteriormente, se vuelven a implantar en el paciente, la zona de la lesión. Los condrocitos se cubren con un colgajo de tejido perióstico para precintar los condrocitos en el lugar de la lesión. Aunque los condrocitos cultivados muestran tendencia a desdiferenciarse en cultivo, en el implante realizado con éxito, los condrocitos desdiferenciados conservan su capacidad de rediferenciación y se rediferenciarán a condrocitos que producen tejido cartilaginoso hialino tras la implantación.

En una técnica modificada conocida como implante de condrocitos autólogos inducidos en matriz (procedimiento de implantación MACI@.) , los condrocitos cultivados se cargan en una matriz de colágeno antes de implantarse en el paciente (Basad y cols., supra) . Además, la matriz de colágeno puede fijarse con adhesivo de fibrina en lugar de suturarse, lo que simplifica la técnica quirúrgica.

Pueden usarse distintas técnicas y medios para cultivar condrocitos. Por ejemplo, se describen ejemplos de medios de cultivo de condrocitos sin suero y métodos de aislamiento y propagación de condrocitos, en las patentes EE. UU. números 6, 150, 163 y 7, 169, 610, y en la solicitud provisional de patente EE. UU. N.º 60/805, 307.

Con los condrocitos pueden aislarse conjuntamente fibroblastos o células fibroblastoides (como los sinoviocitos) y, de este modo, copropagarse en un cultivo celular durante la preparación de implantes de condrocitos. Se sabe que los condrocitos toman el aspecto de fibroblastos cuando se desdiferencian en cultivo (Benya y Shaffer, Cell,

30: 215-224 (1982) ) . Sin embargo, mantienen su capacidad de diferenciación, es decir, son capaces de volver a expresar un fenotipo condrocitario tras la implantación. En consecuencia, puede ser difícil distinguir por su aspecto los condrocitos desdiferenciados cultivados de los fibroblastos o células fibroblastoides cocultivados.

Además, los patrones de expresión génica de los condrocitos desdiferenciados cultivados son distintos de los de los condrocitos nativos del cartílago. Por ejemplo, muchos marcadores netamente expresados en los condrocitos nativos del cartílago presentan un nivel reducido de expresión en los condrocitos cultivados (Binette y cols.,

J. Orthopaed. Res., 16: 207-216 (1998) ) . En consecuencia, la expresión de tal marcador condrocitario puede no distinguir necesariamente un condrocito desdiferenciado de células de otro tipo que puedan estar presentes en el cultivo celular. Además, muchos marcadores conocidos de los fibroblastos se expresan tanto en los condrocitos desdiferenciados como en los condrocitos nativos del cartílago, aunque en diferentes niveles. En consecuencia, el nivel de expresión de tal marcador fibroblástico puede no indicar necesariamente si las células presentes en la muestra sean un condrocitos desdiferenciados, fibroblastos, o células fibroblastoides.

A partir de WO 2006/094836 se conoce un método que distingue entre los condrocitos y los fibroblastos, que se basa en el nivel de expresión y/o de metilación del ADN de siete genes.

Stokes y cols., Arthritis and Rheumatism, vol. 46, no. 2, 2002, pp 404-419 muestra que tanto los condrocitos diferenciados como los desdiferenciados expresan marcadores característicos del cartílago, pero no se comparan con los fibroblastos.

En documentos Martlovits y cols., FASEB Journal, vol. 15, no. 4, 2001, página A34 y Kolettas y cols., J. of Cell Science, vol. 108, no. Parte 5, 1995, pp. 1991-1999 se destaca la similitud en el patrón de expresión de los condrocitos desdiferenciados y los fibroblastos.

Es necesario disponer de métodos para identificar los condrocitos, los fibroblastos y las células fibroblastoides, especialmente, de métodos aplicables al cultivo celular.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En ciertos aspectos, los métodos de la invención proporcionan métodos para evaluar la composición de un cultivo celular (por ejemplo, para distinguir los condrocitos de los fibroblastos) . Los métodos de la invención pueden usarse, por ejemplo, para evaluar los cultivos de condrocitos usados para el tratamiento de defectos del cartílago. Esta invención incluye un método de evaluación de la composición de un cultivo celular, comprendiendo el método:

a) obtener un conjunto de células diversas de un cultivo celular;

b) determinar el nivel de expresión promedio de un marcador fibroblástico en un conjunto diverso de células entre las que el marcador fibroblástico es el MFAP5; y

c) determinar la composición del cultivo basándose en el nivel de expresión promedio de la proteína microfibrilar 5 asociada (MFAP5) ; donde el nivel de expresión medio de MFAP5 por debajo de un determinado umbral indica que el cultivo celular incluye condrocitos.

También incluye un método de evaluación de la composición de un cultivo celular, comprendiendo el método lo siguiente:

a) aislamiento de células de biopsia de cartílago procedente de mamífero;

b) cultivo de células aisladas en el paso a) en un cultivo celular;

c) obtención de una muestra de cultivo celular;

d) determinación del nivel de expresión de MFAP5 y HAPLN 1 en una o más células de la muestra; y –

e) determinación de la composición del cultivo basándose en el nivel de expresión de MFAP5 y HAPLN1.

La invención se basa, al menos en parte, en la identificación del MFAP5 como un marcador del fenotipo celular que se expresa en alto grado en ciertos tipos celulares no condrocitarios, como fibroblastos o sinoviocitos, al tiempo que se expresa en un nivel significativamente inferior en los condrocitos. La invención también se basa, al menos en parte, en el hallazgo de que las proporciones del nivel de expresión de MFAP5 y un marcador condrocitario, como el HAPLN1, constituye un indicador fiable del fenotipo celular en cultivos derivados de biopsias de cartílago. Mientras que bajo ciertas condiciones puede ser preferible usar ambos tipos de marcadores (por ejemplo, marcadores de fibroblastos y condrocitos) para confirmar la composición del cultivo celular o el fenotipo de una célula individual, la invención también proporciona materializaciones en las que la determinación del nivel de expresión normalizada del marcador MFAP5 aislado puede ser suficiente para tal fin.

El nivel de expresión normalizado de MFAP5 es inferior en los condrocitos que en los fibroblastos. En algunas materializaciones, el marcador de los fibroblastos es el MFAP5, y su nivel de expresión normalizado es inferior en los condrocitos (por ejemplo, condrocitos primarios y/o transferidos) que en los fibroblastos y/o los sinoviocitos. En algunas materializaciones, el marcador de los fibroblastos se expresa al menos 2, 5, 8, 10 veces menos en los condrocitos que en los fibroblastos y/o los sinoviocitos.... [Seguir leyendo]

1. método de evaluación de la composición de un cultivo celular, comprendiendo el método lo siguiente:

a) obtener un conjunto de células diversas de un cultivo celular;

b) determinar el nivel de expresión promedio de un marcador fibroblástico en un conjunto diverso de células entre las que el citado marcador fibroblástico es la proteína microfibrilar asociada 5 (MFAP5) ; y

c) determinar la composición del cultivo basándose en el nivel de expresión promedio de la proteína microfibrilar 5 asociada (MFAP5) ; donde el nivel de expresión medio de MFAP5 por debajo de un determinado umbral indica que el cultivo celular incluye condrocitos.

2. El método de la reivindicación 1, donde el marcador fibroblástico MFAP5 es tal que sus niveles de expresión normalizados son inferiores en condrocitos transferidos que en fibroblastos dérmicos o en sinoviocitos.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar el nivel de expresión medio de un marcador condrocitario en el conjunto de células diversas; y, en el paso c) determinar la composición del cultivo basándose en el nivel de expresión promedio del marcador condrocitario y en el nivel de expresión promedio del marcador condrocitario y fibroblástico MFAP5.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el marcador fibroblástico MFAP5 y el marcador condrocitario son tales que la proporción de sus niveles de expresión (marcador condrocitario respecto al marcador fibroblástico) en condrocitos es superior o igual a 5 veces la proporción en fibroblastos dérmicos o sinoviocitos.

5. El método de la reivindicación 3, en el que el marcador condrocitario se selecciona entre los marcadores condrocitarios enumerados en el grupo siguiente:

• Proteína 1 de unión de hialuronano y proteoglicano (HAPLN1)

• Proteína Gla de matriz (MGP)

• Repeticiones tipo GF y dominios tipo discoidina I 3 (EDIL3)

• Proteína 3 de señal inducida por WNT1 (WISP3)

• Agrecano 1 (AGC1)

• Proteína oligomérica de la matriz cartilaginosa (COMP)

• Colágeno de tipo II (COL2A1)

• Colágeno de tipo IX (COL9A1)

• Colágeno de tipo XI (COL11A1)

• Quimiotaxina 1 derivada de células leucocitarias (LECT1)

• Proteína beta fijadora de calcio S 100 (S100B)

• Proteína acídica cartilaginosa 1 (CRTAC1)

• Proteína 9 de la caja SRY (SOX9)

• Nebulette (NEBL)

6. El método de la reivindicación 3, donde el marcador condrocitario es el HAPLN1.

7. El método de la reivindicación 3, donde los niveles de expresión del marcador fibroblástico MFAP5 y los marcadores condrocitarios están determinados a nivel del ARN.

8. El método de la reivindicación 7, donde los niveles de expresión se determinan usando PCR.

9. El método de la reivindicación 8, donde los niveles de expresión se determinan usando el método CT PCR.

10. El método de la reivindicación 3, donde una proporción del nivel de expresión del marcador condrocitario respecto al marcador fibroblástico MFAP5 superior a 0, 25, determinada mediante el método de la CT PCR comparativa, indica que cultivo celular contiene condrocitos.

11. El método de la reivindicación 10, donde la citada proporción indica que cultivo celular contiene al menos un 50 % de condrocitos.

12. El método de la reivindicación 3, donde una proporción molar del marcador condrocitario respecto al marcador fibroblástico MFAP5 superior a 0, 55, indica que cultivo celular contiene condrocitos.

13. El método de la reivindicación 12, donde la citada proporción indica que cultivo celular contiene al menos un 50 % de condrocitos.

14. El método de la reivindicación 1, donde el cultivo celular comprende células obtenidas a partir de una biopsia de cartílago.

15. El método de la reivindicación 14, donde la biopsia de cartílago se obtiene de una articulación de la rodilla.

16. método de evaluación de la composición de un cultivo celular, comprendiendo el método lo siguiente: a) aislamiento de células de biopsia de cartílago procedente de mamífero; b) cultivo de células aisladas en el paso a) en un cultivo celular; c) obtención de una muestra de cultivo celular; d) determinación del nivel de expresión de MFAP5 y HAPLN 1 en una o más células de la muestra; y e) determinación de la composición del cultivo basándose en el nivel de expresión de MFAP5 y HAPLN1.

17. El método de la reivindicación 16, donde los niveles de expresión de MFAP5 y HAPLN1 se determinan a nivel del ARN.

18. El método de la reivindicación 17, donde los niveles de expresión se determinan usando PCR.

19. El método de la reivindicación 18, donde los niveles de expresión se determinan usando el método CT PCR comparativo.

20. El método de la reivindicación 16, donde una proporción del nivel de expresión del HAPLN1 respecto a MFAP5 superior a 0, 25, determinada mediante el método de la CT PCR comparativa, indica que cultivo celular contiene condrocitos.

21. El método de la reivindicación 20, donde la citada proporción indica que cultivo celular contiene al menos un 50 % de condrocitos.

22. El método de la reivindicación 21, donde una proporción molar del HAPLN1 respecto al MFAP5 superior a 0, 55, indica que cultivo celular contiene condrocitos.

23. El método de la reivindicación 22, donde la citada proporción indica que cultivo celular contiene al menos un 50 % de condrocitos.