Método y kit para la detección molecular de Tropheryma whipplei.

La presente invención se refiere a un método para la detección de la bacteria Tropheryma whipplei en una muestra biológica aislada mediante la amplificación con pares de cebadores específicos de uno o más fragmentos de las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, donde dichas secuencias corresponden, respectivamente, a secuencias parciales de la secuencia nucleotídica del gen que codifica para la proteína HSP (Heat shock protein) de 65 kDa, de la secuencia nucleotídica de NCDRC (Non coding degenerated repeat cluster) y de la secuencia nucleotídica del gen que codifica para una proteína de la familia WISP (WNT1 inducible signaling pathway) de Tropheryma whipplei. Preferiblemente la amplificación se lleva a cabo por medio de PCR multiplex. La detección de los productos de la amplificación se lleva a cabo por medio de sondas específicas complementarias a dichos productos. Asimismo, la presente invención se refiere a un kit que comprende los cebadores y sondas específicas para la detección de Tropheryma whipplei.

Método y kit para la detección molecular de Tropheryma whipplei.

La presente invención se refiere a un método para la detección de la bacteria Tropheryma whipplei en una muestra biológica aislada mediante la amplificación con pares de cebadores específicos de uno o más fragmentos de las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEO ID NO: 3, donde dichas secuencias corresponden, respectivamente, a secuencias parciales de la secuencia nucleotídica del gen que codifica para la proteína HSP (Heat shock protein) de 65 kDa, de la secuencia nucleotídica de NCDRC (Non coding degenerated repeat clustei) y de la secuencia nucleotídica del gen que codifica para una proteína de la familia WISP (WNT1 inducible signaling pathway) de Tropheryma whipplei. Preferiblemente la amplificación se lleva a cabo por medio de PCR multiplex. La detección de los productos de la amplificación se lleva a cabo por medio de sondas específicas complementarias a dichos productos. Asimismo, la presente invención se refiere a un kit que comprende los cebadores y sondas específicas para la detección de Tropheryma whipplei.

Estado de la técnica anterior

Tropheryma whipplei es un bacilo gram positivo ubicuo del suelo/agua y que produce en el ser humano un amplio abanico de manifestaciones clínicas. Esta bacteria es la responsable de la denominada enfermedad de Whipple, para la que no existen métodos de diagnóstico clásicos (cultivo y serología), siendo necesario para la confirmación de un caso sospechoso el uso de métodos moleculares y la detección de, al menos, dos regiones genómicas, según el consenso actual. Hasta la fecha todos los métodos publicados se han enfocado en la amplificación de regiones individuales. Las series de casos descritas incluyen patologías como:

- Articular, incluyendo poliartritis simétrica migratoria no erosionante en rodillas, codos y muñecas.

- Digestiva, incluyendo diarrea, síndrome de mala absorción y pérdida de peso.

- Neurológica, con síntomas neurológicos prominentes, como encefalitis.

- Cardiovascular (miocarditis, pericarditis, endocarditis con cultivo negativo, entre otros).

- Mucocutánea.

- Pleuropulmonar.

- Oftalmológica, incluyendo uveitis, vitritis, retinitis y neuritis retrobulbar.

- Enfermedad inflamatoria granulomatosa de ganglios, hígado y bazo.

Las amplias posibilidades de manifestación de la enfermedad implica la necesidad de establecer un diagnóstico diferencial frente a un numeroso grupo de agentes infecciosos que ayude a identificar de forma específica las infecciones por Tropheryma whipplei (T. whipplei). Para el inicio del tratamiento se necesita una identificación de dicha bacteria en muestras clínicas. Por ejemplo, el tratamiento con trimetoprim-sulfametoxazol en combinación con penicilina o claritromicina se ha mostrado exitoso, aunque se ha descrito un 35% de recidivas.

Las muestras clínicas necesarias para un diagnóstico de laboratorio son, igualmente, muy amplias e incluyen desde heces hasta sangre, biopsias, líquidos corporales (LCR, líquido articular, sangre), muestras respiratorias, oculares, etc.

T. whipplei es un agente intracelular facultativo que tiene un tiempo de generación extraordinariamente alto (16 días). Todo esto tiene como consecuencia que el cultivo no pueda ser considerado un método diagnóstico y se reserve para estudios de investigación.

Como consecuencia de lo anterior, no se ha descrito, hasta la fecha, ningún método serológico, probablemente como consecuencia de la dificultad para disponer de material antigénico.

Por otra parte, no existe ningún método de diagnóstico disponible comercialmente. Con estos antecedentes, la única orientación posible para establecer un diagnóstico es la detección de la bacteria T. whipplei mediante la amplificación de fragmentos de regiones genómicas. En este sentido existen una multitud de métodos de PCR descritos, que amplifican regiones individuales del genoma (Blanco et al., 2008. Enferm Infecc Microbiol Clin, 26: 573-580; Schneider et al., 2008. Lancet Infect Dis, 8: 179-190; Fenollar et al., 2007. N Engl J Med, 356: 55-66; Dutly F y Altwegg M, 2001. Clin Microbiol Rev, 14: 561-583). Sin embargo, está aceptado el criterio de necesitar resultados positivos, al menos, frente a dos regiones para confirmar un resultado positivo y ninguno de los métodos descritos resuelve este problema (Rolain et al., 2007. BMC Microbiol., 29: 48).

Por otra parte, la enorme variedad de muestras clínicas susceptibles de ser empleadas en el diagnóstico molecular hace de la especificidad una necesidad importante.

Por tanto, se hace imprescindible resolver los dos problemas actuales planteados: especificidad y necesidad de amplificación de más de una región, para la detección de Tropheryma whipplei.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a un método para la detección de la bacteria Tropheryma whipplei en una muestra biológica aislada mediante la amplificación con pares de cebadores específicos de uno o más fragmentos de las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, donde dichas secuencias corresponden, respectivamente, a secuencias parciales de la secuencia nucleotídica del gen que codifica para la proteína HSP (Heat shock protein) de 65 kDa, de la secuencia nucleotídica de NCDRC (Non coding degenerated repeat clustei) y de la secuencia nucleotídica del gen que codifica para una proteína de la familia WISP (WNT1 inducible signaling pathway) de Tropheryma whipplei. Preferiblemente la amplificación se lleva a cabo por medio de PCR multiplex. La detección de los productos de la amplificación se lleva a cabo por medio de sondas específicas complementarias a dichos productos. Asimismo, la presente invención se refiere a un kit que comprende los cebadores y sondas específicas para la detección de Tropheryma whipplei.

En la presente invención se desarrolla un método que es capaz de detectar fragmentos de tres regiones del genoma de Tropheryma whipplei amplificadas en el mismo ensayo mediante PCR multiplex. Este método va acoplado a un sistema de hibridación en fase sólida frente a sondas moleculares específicas de T. whipplei lo que, además de aumentar la sensibilidad del método, asegura una especificidad máxima. Además, para evitar los falsos positivos debidos a contaminaciones con los controles positivos, se han diseñado fragmentos de ADN sintético siguiendo la secuencia de las dianas seleccionadas (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3). En dichos fragmentos se han incorporado mutaciones en la región que hibrida con la sonda, de manera que sea posible diferenciar de forma visual una reacción frente a la sonda real (que aparecerá en los casos positivos) y frente a la sonda mutada (que debe aparecer exclusivamente en los controles positivos).

El método descrito en la presente invención presenta una serie de ventajas respecto de las técnicas convencionales:

- Fiabilidad y sencillez para identificar bacterias de la especie Tropheryma whipplei en muestras biológicas aisladas.

- Alta sensibilidad. El bajo nº de bacterias de dicha especie presentes en los tejidos (muestras clínicas) hace de este método una herramienta útil donde otros métodos, como por ejemplo los métodos serológicos, son desestimados.

- La técnica de amplificación simultánea mediante PCR multiplex tiene una especificidad del 100%, ya que no amplifica ADN de otras especies bacterianas relacionadas (Tabla 2). La elevada especificidad es debida al empleo de cebadores y sondas moleculares específicas para Tropheryma whipplei. Dicha especificidad evita pasos secundarios como la secuenciación del producto.

- Aumenta el valor predictivo de un resultado positivo en un único ensayo debido a la amplificación y detección conjunta de 3 regiones del genoma. Este hecho supone una determinación más rápida de Tropheryma whipplei respecto de otro tipo de métodos que emplean PCR con uno o dos pares de cebadores.

- Los controles positivos empleados permiten evitar los falsos positivos que pudieran tener lugar como consecuencia de un error de manipulación en la amplificación y/o en...

1. Método para la detección de Tropheryma whipplei que comprende: