SE PRESENTAN UN METODO Y UN APARATO PARA LA FORMACION DE MICROMATRICES DE MUESTRAS BIOLOGICAS SOBRE UN SOPORTE.

EL METODO CONSISTE EN DISTRIBUIR UN VOLUMEN CONOCIDO DE UN REACTIVO EN CADA POSICION SELECCIONADA DE UNA MATRIZ, MEDIANTE LA PUNCION DE UN DISTRIBUIDOR CAPILAR SOBRE EL SOPORTE BAJO CONDICIONES EFECTIVAS COMO PARA EXTRAER UN VOLUMEN DE LIQUIDO DETERMINADO DEL SOPORTE. EL APARATO ESTA DISEÑADO PARA PRODUCIR UNA MICROMATRIZ DE TALES REGIONES DE FORMA AUTOMATIZADA.

Método y aparato para producir microconjuntos de muestras biológicas Campo del invento Este invento se refiere a un método y a un aparato para producir microconjuntos de muestras biológicas para análisis de exploración a gran escala, tales como conjuntos de muestras de ADN que se han de utilizar en análisis de hibridación de ADN para aplicaciones de investigación genética y de diagnóstico.

Referencias

Abouzied y colaboradores, Journal of AOAC International 77 (2) :495-500 (1994) .

Bohlander y colaboradores, Genomics 13:1.322-1.324 (1992) .

Drmanac y colaboradores, Science 260:1.649-1.652 (1993) .

Fodor y colaboradores, Science 251:767-773 (1991) .

Khrapko y colaboradores, DNA Sequence 1:375-388 (1991) .

Kuriyama y colaboradores, AN ISFET BIOSENSOR, APPLIED BIOSENSORS (Donald Wise, coordinador de edición) , Butterworths, páginas 93-114 (1989) .

Lehrach y colaboradores, HYBRIDIZATION FINGERPRINTING IN GENOME MAPPING AND SEQUENCING, GENOME ANALYSIS, VOLUMEN 1 (Davies y Tilgham, coordinadores de edición) , Cold Spring Harbor Press, páginas 39-81 (1990) .

Maniatis y colaboradores, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press (1989) .

Nelson y colaboradores, Nature Genetics 4:11-18 (1993) .

Pirrung y colaboradores, Patente de los EE.UU. 5.143.854 (1992) .

Riles y colaboradores, Genetics 134:81-150 (1993) .

Schena M. y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:3.894-3.898 (1992) .

Southern y colaboradores, Genomics 13:1.008-1.017 (1992) .

Antecedentes del invento

Actualmente se encuentran disponibles una diversidad de métodos para producir conjuntos de macromoléculas biológicas, tales como conjuntos de moléculas de ácidos nucleicos o proteínas. Un método para producir conjuntos ordenados de ADN sobre una membrana porosa es un enfoque de "borrones de puntos = dot blot". En este método, un múltiple distribuidor en vacío transfiere una pluralidad, p. ej. de 96 muestras acuosas de ADN desde pocillos con un diámetro de 3 milímetros a una membrana porosa. Una variante corriente de este procedimiento es un método de "borrones de rendijas = slot-blot", en el que los pocillos tienen unas formas ovaladas muy alargadas.

El ADN es inmovilizado sobre la membrana porosa cociendo la membrana o exponiéndola a radiación de UV. Éste es un procedimiento manual que resulta práctico para producir una agrupación de una sola vez y está usualmente limitado a 96 muestras por conjunto. Por lo tanto, los procedimientos de "borrones de puntos" son inadecuados para aplicaciones en las cuales han de determinarse muchos millares de muestras.

Una técnica más eficaz, empleada para producir conjuntos ordenados de fragmentos genómicos, utiliza un conjunto de alfileres sumergidos en los pocillos, p. ej. en los 96 pocillos de una placa de microtitulación, para transferir un conjunto muestras a un substrato, tal como una membrana porosa. Un conjunto incluye alfileres que están diseñadas para motear una membrana de una manera escalonada, para crear un conjunto de 9.216 motas en una zona de 22 x 22 cm (Lehrach, y colaboradores, 1990) . Una limitación que se presenta con este enfoque consiste en que el volumen de ADN moteado en cada pixel (elemento de imagen) de cada conjunto es muy variable. Además, el número de conjuntos que se pueden producir con cada inmersión es usualmente bastante pequeño.

Un método alternativo para crear conjuntos ordenados de secuencias de ácidos nucleicos ha sido descrito por Pirrung y colaboradores (1992) , y también por Fodor y colaboradores (1991) . El método implica sintetizar diferentes secuencias de ácidos nucleicos en diferentes regiones discretas de un soporte. Este método emplea complicados esquemas de síntesis, y está limitado generalmente a una muestra de un ácido nucleico relativamente corto, p. ej. menor que 20 bases. Un método relacionado ha sido descrito por Southern y colaboradores (1992) .

Khrapko y colaboradores (1991) describen un método para producir una matriz de oligonucleótido moteando (aplicando en motas) un ADN sobre una delgada capa de poliacrilamida. El moteado (la aplicación de motas) se hace manualmente con una micropipeta.

Ninguno de los métodos o dispositivos descritos en la técnica anterior está diseñado para la producción a gran escala de microconjuntos, caracterizados por (i) un gran número de regiones de análisis dimensionadas en micrómetros, separadas por una distancia de 50-200 micrómetros o menos, y (ii) una cantidad bien definida, típicamente en el margen de los picomoles, de un analito asociado con cada región del conjunto.

Además, la tecnología actual se dirige a la realización de tales análisis de una sola vez para un único conjunto de moléculas de ADN. Por ejemplo, el método más corriente de realizar hibridaciones de ADN en conjuntos moteados sobre una membrana porosa implica cerrar herméticamente la membrana en una bolsa de material plástico (Maniatis y colaboradores, 1989) o un cilindro de vidrio giratorio (Robbins Scientific) estando la sonda de hibridación marcada dentro de la cámara herméticamente cerrada. Para conjuntos producidos sobre superficies no porosas, tal como un portaobjetos de microscopio, cada conjunto es incubado con la sonda de hibridación marcada cerrada herméticamente bajo un cubreobjetos. Estas técnicas requieren una cámara herméticamente cerrada por separado para cada conjunto, lo cual hace que la exploración y la manipulación de muchos de estos conjuntos resulten inconvenientes y consuman mucho tiempo.

Abouzied y colaboradores (1994) describen un método para imprimir líneas horizontales de anticuerpos sobre una membrana de nitrocelulosa y separar regiones de la membrana con franjas verticales de un material hidrófobo. Luego, cada franja vertical se hace reaccionar con un antígeno diferente y se detecta la reacción entre el anticuerpo inmovilizado y un antígeno utilizando una técnica colorimétrica ELISA normalizada. La técnica de Abouzied hace posible explorar muchos conjuntos unidimensionales de modo simultáneo sobre una única lámina de nitrocelulosa. Abouzied hace a la nitrocelulosa algo hidrófoba utilizando una línea trazada con el estilete PAP Pen (Research Products International) . Sin embargo, Abouzied no describe ninguna tecnología que sea capaz de obturar por completo los poros de la nitrocelulosa. Los poros de la nitrocelulosa están todavía físicamente abiertos y de este modo los reactivos para el análisis se pueden derramar a través de la barrera hidrófoba durante prolongadas incubaciones a altas temperaturas o en presencia de detergentes, lo cual hace que la técnica de Abouzied sea inaceptable para análisis de hibridación de ADN.

Existen membranas porosas con diseños impresos de regiones hidrófilas/hidrófobas para aplicaciones tales como conjuntos ordenados de colonias de bacterias. La entidad QA Life Sciences (San Diego CA) produce tal membrana con un diseño de rejilla impreso sobre ella. Sin embargo, esta membrana tiene la misma desventaja que la técnica de Abouzied, puesto los que los reactivos pueden todavía circular entre los conjuntos enrejillados haciéndolos inútiles para análisis de hibridación de ADN por separado.

La entidad Pall Corporation produce una placa de 96 pocillos con un filtro poroso termosellado al fondo de la placa. Estas placas son capaces de contener diferentes reactivos en cada pocillo sin contaminación cruzada entre ellos. Sin embargo, cada pocillo está destinado a contener solamente un elemento diana mientras que el invento aquí descrito produce un microconjunto de muchas biomoléculas en cada región subdividida del soporte sólido. Además, las placas de 96 pocillos tienen un espesor de al menos 1 cm e impiden el uso del dispositivo para muchos formatos de detección colorimétricos, fluorescentes y radiactivos, que requieren que la membrana se coloque de modo plano contra la superficie de detección. El invento aquí descrito no requiere ningún tratamiento adicional después de la operación de análisis, puesto que los elementos de barreras son poco profundos y no interfieren con la operación de detección, aumentando con ello en gran manera la utilidad.

La entidad Hyseq Corporation ha descrito un método producir un "conjunto de conjuntos" sobre un soporte sólido no poroso para utilizarlo en su secuenciación por la técnica de hibridación. El método descrito por Hyseq implica modificar las... [Seguir leyendo]

1. Un método para formar un microconjunto de regiones de análisis específicas para un analito sobre un soporte sólido o una pluralidad de soportes sólidos, que comprende:

(a) cargar una solución de un reactivo de análisis específico para un analito en un dispositivo distribuidor de reactivos, que tiene un canal capilar alargado (i) formado por miembros alargados de la misma extensión y separados entre sí, (ii) adaptado para retener una cantidad seleccionada de la solución de reactivo, y (iii) que tiene una región de punta en la que la solución de reactivo existente en el canal forma un menisco,

(b) golpear ligeramente la punta del dispositivo distribuidor contra el soporte sólido en una posición definida del soporte sólido, con un impulso eficaz para romper el menisco en el canal capilar y depositar un volumen seleccionado de la solución de reactivo sobre el o los soporte (s) sólido (s) , y

(c) repetir las operaciones (a) y (b) con diferentes reactivos de análisis específicos para analitos, depositados en diferentes posiciones definidas sobre el (los) soporte (s) sólido (s) , hasta que se formen el (los) microconjunto (s) .

2. El método según la reivindicación 1, en el que el microconjunto tiene regiones discretas de análisis, específicas para analitos, y cada región discreta en el microconjunto tiene un reactivo de análisis seleccionado, específico para un analito.

3. El método según la reivindicación 2, en el que el volumen seleccionado se encuentra entre 0, 002 y 2 nl.

4. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que los reactivos de análisis específicos para un analito son cadenas de ácidos nucleicos y en que el microconjunto tiene al menos aproximadamente 1.000 regiones discretas por cm2 del soporte sólido.

5. El método de la reivindicación 4, en el que las cadenas de ácido nucleico son polinucleótidos distintos y en el que cada polinucleótido distinto está colocado en una región separada del microconjunto.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende, después de haber realizado las operaciones (a) y (b) , la operación de volver a cargar el dispositivo distribuidor de reactivos con una nueva solución de reactivo de análisis específico para un analito mediante las operaciones de (i) sumergir el canal capilar del dispositivo en una solución de lavado, (ii) eliminar la solución de lavado arrastrada dentro del canal capilar, y (iii) sumergir el canal capilar en la nueva solución de reactivo.

7. El método de las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende la operación de inmovilizar los polinucleótidos distintos en las regiones separadas del microconjunto.

8. Un aparato útil para formar un microconjunto de regiones de análisis de analitos sobre una pluralidad de soportes sólidos, en el que cada región tiene un reactivo seleccionado, específico para un analito, que comprende

(a) una montura para sostener, en posiciones conocidas, una pluralidad de soportes planos,

(b) un dispositivo distribuidor de reactivos que tiene un canal capilar alargado abierto formado por miembros alargados de la misma extensión y separados entre sí, adaptados para sostener una cantidad de la solución de reactivo y que tiene una región de punta en la que la solución de reactivo existente en el canal forma un menisco,

(c) medios de colocación para colocar el dispositivo distribuidor en una posición seleccionada del conjunto con respecto a un soporte en dicha montura,

(d) medios distribuidores para mover el dispositivo a aplicación de golpeo ligero contra un soporte con un impulso seleccionado, cuando el dispositivo distribuidor está colocado en una posición definida del microconjunto con respecto a ese soporte, con un impulso eficaz para romper el menisco de líquido en el canal capilar y depositar un volumen seleccionado de solución sobre la superficie, y

(e) medios de control para controlar y posicionar los medios distribuidores.

9. El aparato de la reivindicación 8, en el que el dispositivo distribuidor de reactivos deposita entre aproximadamente 0, 002 y 100 nl del reactivo para análisis específico para un analito en cada región del microconjunto.

10. Un substrato con una superficie que comprende un microconjunto de distintos polinucleótidos, en el que (i) el microconjunto tiene al menos aproximadamente 1.000 regiones discretas de polinucleótidos por cm2 de superficie del substrato, (ii) cada polinucleótido distinto está colocado en una región separada del microconjunto, y (iii) cada polinucleótido distinto tiene una longitud de al menos 50 subunidades.

11. Un substrato con una superficie que comprende un microconjunto de polinucleótidos distintos que tienen una longitud de al menos 50 subunidades, obtenible por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el microconjunto tiene al menos aproximadamente 1.000 regiones discretas de polinucleótidos distintos por cm2 de superficie del substrato.

12. El substrato de la reivindicación 10 ó 11, en el que la superficie del substrato es hidrófoba.

13. El substrato de la reivindicación 10 ó 11, en que este substrato es vidrio.

14. El substrato de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que los polinucleótidos son secuencias derivadas de ARNm, secuencias de ADN genómico o fragmentos de ellas.