Método para la selección in vitro de un inhibidor de la migración de células cancerosas que inhibe la actividad de SK3,

caracterizado porque comprende:

(i) poner en contacto una célula que expresa un SK3 funcional, con un compuesto candidato y medir el nivel de actividad de SK3;

(ii) comparar el nivel de actividad de SK3 que se mide en la etapa (i) con el nivel de actividad de SK3 que se mide cuando la etapa (i) se realiza en ausencia de dicho compuesto candidato, en el que una disminución de la actividad de SK3 en presencia del compuesto candidato indica que el candidato es un inhibidor de la migración de células cancerosas, en el que la actividad de SK3 se mide usando un ensayo de migración celular, y porque dicho método comprende una etapa preliminar antes de la etapa (i) que comprende

(a) incubar un compuesto candidato que va a someterse a prueba con SK3, y

(b) someter a ensayo para determinar la unión del compuesto candidato que va a someterse a prueba con SK3, y

(c) seleccionar positivamente un compuesto candidato que va a usarse en la etapa (i) si dicho compuesto candidato se une a SK3.

Método para la selección in vitro de compuestos anticancerígenos que inhibe la actividad de SK3, y dichos compuestos anticancerígenos

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a métodos para inhibir las propiedades migratorias de células que expresan SK3 para el tratamiento de cánceres tales como melanomas y cánceres de mama. La invención se refiere además a métodos de selección de fármacos diseñados para identificar compuestos que inhiben la actividad de SK3 y al uso de dichos compuestos en el tratamiento de cánceres.

Estado de la técnica

A pesar de las enormes inversiones de recursos económicos y humanos, el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte. Los actuales tratamientos contra el cáncer sólo curan aproximadamente al cincuenta por ciento de los pacientes que desarrollan un tumor maligno. En la mayoría de los tumores malignos, la metástasis es la principal causa de muerte.

La metástasis es la formación de una colonia tumoral secundaria en un sitio distante. Es un procedimiento de múltiples etapas en el que la invasión tumoral es un acontecimiento temprano. Las células tumorales invaden localmente barreras tisulares del huésped, tales como la membrana basal epitelial, para alcanzar el estroma intersticial, en el que obtienen acceso a vasos sanguíneos ("metástasis hematógena") o conductos linfáticos para su diseminación adicional. Tras invadir la capa endotelial de una pared de vaso, las células tumorales circulantes se desplazan hacia la circulación y se detienen en las vénulas precapilares del órgano diana mediante adherencia a superficies luminales de células endoteliales, o membranas basales expuestas. Las células tumorales invaden de nuevo la pared vascular para entrar en el parénquima del órgano. Finalmente, la célula tumoral extravasada crece en un tejido diferente de aquél a partir del que se originó.

A medida que los tratamientos contra el cáncer que usan radioterapias y/o quimioterapias se vuelven más eficaces, y más personas viven durante periodos de tiempo más largos tras el tratamiento, los supervivientes del cáncer se enfrentan con un riesgo significativo de desarrollar tumores secundarios inducidos por la terapia.

Debido a la mutagenicidad inherente de la radiación ionizante y la mayoría de los fármacos anticancerígenos, los investigadores pronosticaron que los tumores secundarios inducidos por la terapia se convertirían en un problema de salud importante.

Debido a las dificultades en los enfoques actuales para el tratamiento y la prevención de metástasis, existe una necesidad en la técnica de compuestos terapéuticamente útiles novedosos para impedir la aparición en individuos de metástasis en el transcurso de un cáncer.

Adicionalmente, en la mayoría de tumores malignos humanos, las metástasis distantes son con frecuencia demasiado pequeñas para detectarse en el momento en que se trata el tumor primario. Además, la iniciación extendida de colonias metastásicas se produce habitualmente antes de que sean evidentes los síntomas clínicos de la enfermedad metastásica. El tamaño y la variación de edad en las metástasis, su ubicación anatómica dispersa y su composición heterogénea son todos factores que dificultan la extirpación quirúrgica y limitan la concentración de fármacos anticancerígenos que pueden suministrarse a las colonias metastásicas.

Por consiguiente, todavía existe una necesidad en la técnica de métodos que permitirán que un experto en la técnica determine el estado de progresión de cánceres en pacientes de modo que permita un pronóstico preciso de la evolución de la enfermedad, incluyendo la aparición de metástasis, y también permita una monitorización precisa del tratamiento terapéutico que puede ser el más beneficioso para el paciente, una vez que se ha tenido en cuenta el estado de progresión del cáncer. Por ejemplo, existe una necesidad en la técnica de marcadores biológicos novedosos que sean indicativos de la aparición de un cáncer. Estos marcadores biológicos novedosos podrían usarse en combinación con uno o varios marcadores ya conocidos.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es, por tanto satisfacer estas necesidades y proporcionar además otras ventajas relacionadas.

Descripción de las figuras

Figura 1: Participación de canales SK en la migración de células MDA-MB-435s. Histogramas que muestran el efecto inhibidor sobre la migración celular de apamina (A) , Lei-Dab7, TEA, 4-AP (B) y concentración creciente de K+ externo (C) . Se sembraron células a 40000 en un inserto de cultivo celular en DMEM con FBS al 5% ± fármacos o [K+] 60 mM. El compartimento inferior del inserto contenía DMEM con FBS al 10% como quimioatrayente ± fármacos o [K+] 60 mM. Después de 24 h, se tiñeron las células del compartimento inferior con hematoxilina (A, parte inferior) y se contaron. El número de células normalizado correspondía a la razón del número total de células en migración en presencia de fármaco o [K+] 60 mM / número total de células en migración en experimentos de control. Las concentraciones de fármaco seleccionadas no tienen ningún efecto sobre la proliferación y viabilidad celulares (ejemplo con apamina en A, inserto) . Barra de escala = 10 !m para los dos paneles. Los resultados de los dos experimentos separados realizados por triplicado se expresan como la media ± E.E.M. * significativamente diferente del control a p < 0, 05.

Figura 2: Regulación del potencial de membrana en reposo mediante canales SK en células MDA-MB-435s. A-Ejemplo de corrientes de K+ macroscópicas de célula completa registradas en una célula sin apamina (control) o con apamina en el medio externo. Se generaron corrientes mediante pulsos despolarizantes de 8 mV graduales (duración de 400 ms; intervalos de 5 s) a partir de un potencial de retención constante de -70 mV hasta +58 mV. Se filtraron las señales a 1 kHz y se digitalizaron a 10 kHz.

B, C- Se obtuvo la densidad de corriente dividiendo la corriente en estado estacionario promediada provocada a +26 mV (registrada durante los últimos 50 ms del pulso) entre la capacidad celular respectiva. Se calculó la capacidad de membrana integrando la corriente capacitiva medida durante una etapa de voltaje de 10 mV. Los resultados se expresan como la media ± E.E.M. de los efectos inhibidores de apamina (n = 4) , TEA (n = 7) , 4-AP (n = 8) y TEA más 4-AP (n = 3) . D- Variaciones de potencial de membrana registradas en condiciones de control (PSS sin fármacos, n = 11) y en presencia de TEA (n = 7) , 4-AP (n = 8) y TEA más 4-AP (n = 3) . Se midió el potencial de membrana en modo de fijación de corriente (I = 0) justo después de la ruptura de la pequeña extensión de membrana. Los resultados se expresan como la media ± E.E.M. * significativamente diferente del control a p < 0, 05.

Figura 3: La proteína SK3 se expresa en MDA-MB-435s y en tejido tumoral de mama. A- La detección de ARNm de canales SK (SK1, SK2, SK3 y SK4) en MDA-MB-435s. Se realizó RT-PCR en células MDA-MB-435s y en ADNc de SNC humano como control positivo. Los cebadores usados para los experimentos de RT-PCR se enumeran en la sección de Materiales y métodos. Ejemplos representativos de tres experimentos separados.

B- Patrón de inmunotransferencia de tipo Western representativo de expresión de proteínas SK2 y SK3 en líneas celulares epiteliales de mama cancerosas y no cancerosas. Se prepararon lisados de líneas celulares de cáncer de mama humanas (MDA-MB-435s, MDA-MB-231, MCF-7, T47D y SKBR3) , de líneas celulares epiteliales de mama no cancerosas (184A1, MCF-10A) y de tejido de hipocampo de rata (usado como control positivo) en tampón de lisis (SDS al 5%, inhibidores de proteasa al 1%, PMSF 200 mM) . Se sometieron los extractos celulares a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en condiciones reductoras y se detectó la señal mediante ECL. Se proporcionaron los resultados por triplicado.

Figura 4: La destrucción del transcrito del gen SK3 disminuye la migración de células MDA-MB-435s y la expresión del gen SK3 aumenta la migración de células 184A1.

A- Parte superior, patrones de inmunotransferencia de tipo Western que muestran el efecto de silenciamiento sobre la expresión de proteína SK3 de dos ARNip diseñados contra ARNm de SK3. Se transfectaron las células con complejos de ARNip-lipofectamina durante 24 h, 48 h y 72 h. Se usó un ARNip desordenado como control negativo. Las secuencias de oligonucleótidos de ARNip se enumeran... [Seguir leyendo]

1. Método para la selección in vitro de un inhibidor de la migración de células cancerosas que inhibe la actividad de SK3, caracterizado porque comprende:

(i) poner en contacto una célula que expresa un SK3 funcional, con un compuesto candidato y medir el nivel de actividad de SK3;

(ii) comparar el nivel de actividad de SK3 que se mide en la etapa (i) con el nivel de actividad de SK3 que se mide cuando la etapa (i) se realiza en ausencia de dicho compuesto candidato, en el que una disminución de la actividad de SK3 en presencia del compuesto candidato indica que el candidato es un inhibidor de la migración de células cancerosas,

en el que la actividad de SK3 se mide usando un ensayo de migración celular, y porque dicho método comprende una etapa preliminar antes de la etapa (i) que comprende

(a) incubar un compuesto candidato que va a someterse a prueba con SK3, y

(b) someter a ensayo para determinar la unión del compuesto candidato que va a someterse a prueba con SK3, y

(c) seleccionar positivamente un compuesto candidato que va a usarse en la etapa (i) si dicho compuesto candidato se une a SK3.

2. Método para la evaluación in vitro de la capacidad de células cancerosas de un sujeto para migrar, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de:

(i) cuantificar la actividad de SK3 en una muestra que comprende células cancerosas de un tipo de tejido específico obtenida de un sujeto con cáncer, en un primer punto de tiempo,

(ii) cuantificar la actividad de SK3 en una muestra que comprende células cancerosas del mismo tipo de tejido, obtenida de dicho sujeto con cáncer, en un punto de tiempo posterior, en el que un nivel superior de actividad de SK3 en la etapa (ii) , en comparación con la etapa (i) , indica un aumento de la capacidad de las células cancerosas del sujeto para migrar, y un nivel inferior de actividad de SK3 en la etapa (ii) , en comparación con la etapa (i) , indica una disminución de la capacidad de las células cancerosas del sujeto para migrar,

en el que la actividad de SK3 se mide detectando:

• el nivel de flujo de salida de K+ de la célula que expresa SK3;

• el nivel de Ca2+ intracelular en la célula que expresa SK3; o

• el nivel de expresion de SK3.

3. Método para la evaluación in vitro de la capacidad de células cancerosas de un sujeto para migrar, según la reivindicación 2, caracterizado porque la actividad de SK3 se mide detectando el nivel de flujo de salida de K+ de la célula que expresa SK3.

4. Método para la evaluación in vitro de la capacidad de células cancerosas de un sujeto para migrar, según la reivindicación 2, caracterizado porque la actividad de SK3 se mide detectando el nivel de Ca2+ intracelular en la célula que expresa SK3.

5. Método para la evaluación in vitro de la capacidad de células cancerosas de un sujeto para migrar, según la reivindicación 2, caracterizado porque la actividad de SK3 se mide detectando el nivel de expresión de SK3.

6. Método para la evaluación in vitro de la capacidad de células cancerosas de un sujeto para migrar, según la reivindicación 5, caracterizado porque el nivel de expresión de SK3 se mide detectando SK3 con un anticuerpo dirigido contra SK3.

7. Método para la evaluación in vitro de la capacidad de células cancerosas de un sujeto para migrar, según la reivindicación 5, caracterizado porque el nivel de expresión de SK3 se mide detectando ARN de SK3.

8. Método para la evaluación in vitro de la capacidad de células cancerosas de un sujeto para migrar, según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en un cáncer de mama o un melanoma.

9. Anticuerpo dirigido contra SK3 caracterizado porque bloquea SK3 para su uso en la inhibición de la migración de células cancerosas en un paciente con cáncer.

10. Anticuerpo dirigido contra SK3 según la reivindicación 9, para su uso en la inhibición de la migración de células cancerosas según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho cáncer se selecciona del grupo 10 que consiste en un cáncer de mama o un melanoma.