Método para la inactivación certificable de patógenos por irradiación en un fluido biológico.

Método para determinar una dosis efectiva de luz monocromática o policromática de una o más fuentes luminosas en un reactor de irradiación luminosa para inactivar microorganismos en un fluido biológico,

que comprende medir el efecto de la luz monocromática o policromática en una solución dosimétrica que adapta la absorbancia y la viscosidad del fluido biológico a las longitudes de onda de fotoinactivación utilizadas en base a una calibración de la dosis de luz, mediante i) irradiación de dicha solución dosimétrica en una capa de longitud de camino óptico lo suficientemente delgada para absorber sólo una fracción de la luz incidente con una irradiancia definida predeterminada durante un tiempo determinado para aplicar una dosis de luz determinada, conduciendo a un cambio mensurable en un fotoproducto, y ii) lectura de la dosis correspondiente al cambio en dicho fotoproducto durante o después de la irradiación luminosa de dicha solución dosimétrica en dicho reactor de irradiación luminosa, ejecutándose el paso i) antes del paso ii) y seleccionándose el fluido biológico de entre el grupo consistente en fluidos que comprenden sobrenadante de cultivo celular procariota, sobrenadante de cultivo celular eucariota, lisado celular procariota, lisado celular eucariota, sangre, plasma, fracciones de plasma, suero y fluidos derivados de sangre, plasma y suero, comprendiendo la solución dosimétrica un actinómetro de yoduro de potasio-yodato de potasio/polivinilpirrolidona diluido.

Método para la inactivación certificable de patógenos por irradiación en un fluido biológico.

La presente invención se refiere a un método para la inactivación fotoquímica de patógenos mediante irradiación por lotes, la cual, antes de la presente invención, se consideraba demasiado compleja e impracticable. En particular, la invención permite ventajosamente al experto en la técnica determinar una dosis de luz eficaz para la inactivación fotoquímica de patógenos.

El tratamiento de la sangre, de células sanguíneas, plasma, suero, fracciones de plasma y de otros fluidos biológicos y soluciones proteínicas mediante irradiación para inactivar virus patógenos, en particular virus de ADN monocatenario sin envoltura pequeños, se está investigando ampliamente. Ejemplos de tratamientos por irradiación actualmente en estudio incluyen con luz ultravioleta de onda corta, luz ultravioleta de onda larga, luz visible con compuestos fotosensibilizantes y destellos de luz de alta intensidad de alto espectro.

En la década los '30 se expusieron pequeños volúmenes de sangre total autóloga a la radiación UV de una lámpara de vapor de mercurio de presión media para inactivar los organismos infecciosos. Con la reinfusión de la sangre irradiada se observaba un aparente efecto inmunoestimulatorio.

Entre 1946 y 1955 se investigó en Estados Unidos el tratamiento de pooles de plasma con luz UV-C para inactivar agentes infecciosos. Los primeros resultados alentadores condujeron a un tratamiento con UV-C a 253, 7 nm como el requisito mínimo para un plasma humano terapéuticamente aplicable (Murray y col., 1955) . Con la introducción de la espectrofotometría electrónica se comprobó que el plasma y las soluciones de cultivos virales que contenían plasma o suero eran ópticamente opacos a la luz de 253, 7 nm, con una profundidad de penetración inferior a 1 mm (Suhrmann y Kollath, 1928) . Por esta razón se construyeron diversos irradiadores de película delgada para esterilizar volúmenes grandes de plasma o para atenuar las vacunas. Ejemplos de ellos son el irradiador de Habel-Sockrider (Habel y Sockrider, 1947) , el dispositivo generador de películas centrífugo de Milzer-Oppenheimer-Levison con lámparas refrigeradas por agua (Milzer y col., 1945; Benesi 1956; Taylor y col., 1957a; Taylor y col., 1957b; McLean y Taylor 1958; Oppenheimer y col., 1959) y el irradiador de Dill (Murray y col., 1955) (Dill Instruments Co.) , que es el único diseño que sigue estando disponible en el mercado.

A pesar de los avances citados, la hepatitis sérica persistía (Neefe 1949; Barnett y col., 1950; James y col., 1950) . Ciertos estudios exhaustivos determinaron que las dosis UV requeridas para inactivar el virus de la hepatitis B reducían seriamente la actividad biológica de las proteínas palsmáticas, abandonándose este método a finales de la década de los '50 (Murray y col., 1955; Kallenbach y col., 1989) . En 1958 se introdujo una administración combinada mejorada de beta-propiolactona e irradiación subsiguiente con UV-C. Este proceso permitía inactivar los virus de la hepatitis sérica, pero dejaba intactas al menos las actividades biológicas del complejo de protrombina, las inmunoglobulinas y la albúmina (Smolens y Stokes, 1954; Hartman y col., 1955; Prince y col., 1983) . Desde 1968 en adelante, este proceso fue el empleado en los fraccionadores de plasma comerciales para producir concentrados séricos combinados de albúmina-inmunoglobulina y a partir de 1976 para producir concentrados de complejo de protrombina empleando un irradiador UV de película delgada Dill (Stephan y col., 1981, Stephan, 1982a, 1982b) . Los estudios con chimpancés y posteriormente en cultivos celulares demostraron una inactivación efectiva de la hepatitis A, B y C (Heinrich y col., 1982, 1987, Frösner y col., 1983, Prince y col., 1983, 1984, Stephan, 1989) , mientras que el VIH demostró ser más resistente a la luz UV-C (Dichtelmüller y col., 1987, 1993) . La aparente insuficiencia del tratamiento con beta-propiolactona /UV-C para inactivar el virus del SIDA, el VIH, en un concentrado de complejo de protrombina (Kleim y col., 1990, Kupfer y col., 1995) y la disponibilidad de otros métodos de inactivación física y fisicoquímica, como el tratamiento térmico o con detergentes, condujo al abandono del método betapropiolactona/UV-C en 1990 (Pustoslemsek y col., 1993) .

En la década de los '80, Dichtelmüller y col. (1987) y Kallenbach y col. (1989) confirmaron que la irradiación UV-C sola requeriría dosis excesivamente altas para inactivar el VIH en plasma sanguíneo y que la irradiación UV-B era ineficaz para la inactivación de patógenos (Prodouz y col., 1987) .

Por otro lado, los virus de ADN sin envoltura pequeños que no son lo suficientemente sensibles a los métodos de inactivación física y fisicoquímica se inactivan de forma eficaz con luz UV-C. Un ejemplo es la familia de los parvovirus, por ejemplo el Virus Kilham de la rata (Proctor y col., 1972) , el Virus Minute Murino (MMV) (Harris y col., 1974, Rommelaere y col., 1981) y el Parvovirus Porcino (PPV) (Brown, 1981) . Por ejemplo, la Patente US 6.190.608 describe que una fluencia UV-C a 253, 7 nm (distancia entre la energía radiante incidente en la muestra dividida entre su área, expresada como erg/mm2, mJ/cm2 o J/m2) de 12 mJ/cm2 inactivaba el MMV en una solución que contenía 2 mg de inmunoglobulinas/ml.

Además, una fluencia de 9-25 mJ/cm2 es suficiente para inactivar parvovirus en una solución concentrada de fibrinógeno (WO 96/02571) o en una solución diluida de factores de coagulación purificados (publ. de patente JP 196531/1995) . Se ha informado de que una dosis UV más alta, de 100 mJ/cm2, es la mínima necesario para el plasma (Chin y col., 1995) , el fibrinógeno (Marx y col., 1996) , la albúmina, las inmunoglobulinas (Hart y col., 1993; Chin y col., 1997) y el suero animal (Kurth y col., 1999) , aunque fluencias tan bajas como de 50 mJ/cm2 inactivan de forma efectiva los parvovirus (Chin y col., 1997) .

Otros ejemplos de tratamiento de muestras biológicas, como plasma y glóbulos rojos, incluyen la generación de oxígeno singlete mediante un fotosensibilizador y luz o mediante efectos de fotólisis flash de alta intensidad, destellos de luz de amplio espectro en un tubo de xenón. Los avances técnicos en la medida electrónica de la luz y la disponibilidad de radiómetros digitales facilitó la determinación de la irradiancia de una fuente luminosa, de modo que ya los datos de fluencia se determinan y revelan de forma rutinaria.

Las proteínas plasmáticas han demostrado una alta sensibilidad a la irradiación UV o a la irradiación fotosensibilizada. La alteración del plasma y de las proteínas plasmáticas irradiados con UV-C condujo a una prolongación del tiempo de coagulación (Cutler y col., 1950; Cutler y col., 1955) , a un cambio de la movilidad electroforética (Hellbrügge y Marx, 1952; Larin, 1958) , a una agregación (Engelhard y Eikenberg, 1955) , a una alteración de las propiedades de sedimentación en ultracentrifugación (Claesson, 1956) y a una reducción del título de anticuerpos (Battisto y col., 1953; Kleczowski, 1954) . Por ejemplo, el fibrinógeno tratado con UV-C sufre una disminución de la elasticidad del coágulo (Di Benedetto y col., 1963a, 1963b, 1963c) y la coagulación se retrasa a > 100 mJ/cm2 (Marx y col., 1996) ; la actividad del factor VIII se reduce en plasma tratado con UV-C (Kallenbach y col., 1989; Chin y col., 1995) ; el tiempo de coagulación del fibrinógeno aumenta notablemente y la actividad del factor von Willenbrand y del factor VIII disminuye ligeramente en plasma recién congelado tratado con azul de metileno/luz (Aznar y col., 1999) .

Para reducir al mínimo el efecto nocivo de la ionización y la radiación con UV-C en proteínas, se han utilizado agentes de extinción de las especies radicales de oxígeno, en particular el flavonoide rutina (Erdmann, 1956, WO 948210) , ácido ascórbico (Erdmann, 1956) y creatinina (JP 11286453-A) , así como un aditivo de absorción de UV-C. Sin embargo, aunque estos aditivos complementan una absorbancia adicional a la longitud de onda utilizada, en realidad a los patógenos llega muy poca energía UV-C. No obstante, aplicar un exceso de energía deteriora fácilmente las proteínas y, por ello, es necesario no superar la dosis UV o de luz visible necesaria para una inactivación suficiente de los patógenos y calcular o determinar esta dosis con la mayor precisión posible.

Otra posibilidad para proteger als proteínas frente al oxígeno singlete, el cual es generado a partir del oxígeno atmosférico... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar una dosis efectiva de luz monocromática o policromática de una o más fuentes luminosas en un reactor de irradiación luminosa para inactivar microorganismos en un fluido biológico, que comprende medir el efecto de la luz monocromática o policromática en una solución dosimétrica que adapta la absorbancia y la viscosidad del fluido biológico a las longitudes de onda de fotoinactivación utilizadas en base a una calibración de la dosis de luz, mediante i) irradiación de dicha solución dosimétrica en una capa de longitud de camino óptico lo suficientemente delgada para absorber sólo una fracción de la luz incidente con una irradiancia definida predeterminada durante un tiempo determinado para aplicar una dosis de luz determinada, conduciendo a un cambio mensurable en un fotoproducto, y ii) lectura de la dosis correspondiente al cambio en dicho fotoproducto durante o después de la irradiación luminosa de dicha solución dosimétrica en dicho reactor de irradiación luminosa, ejecutándose el paso i) antes del paso ii) y seleccionándose el fluido biológico de entre el grupo consistente en fluidos que comprenden sobrenadante de cultivo celular procariota, sobrenadante de cultivo celular eucariota, lisado celular procariota, lisado celular eucariota, sangre, plasma, fracciones de plasma, suero y fluidos derivados de sangre, plasma y suero, comprendiendo la solución dosimétrica un actinómetro de yoduro de potasio-yodato de potasio/polivinilpirrolidona diluido.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque adicionalmente incluye la inactivación de microorganismos en dicho fluido biológico mediante irradiación del fluido biológico con la dosis efectiva determinada de luz monocromática o policromática procedente de una o varias fuentes luminosas.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque a lo largo de la longitud del camino óptico se absorbe el 100% o menos de la irradiancia incidente.

4. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque a lo largo de la longitud del camino óptico se absorbe un 50% o menos de la irradiancia incidente.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque adicionalmente incluye la determinación de la distribución de dosis mediante titulación de la cantidad de microorganismos viables antes y después o antes, durante y después de irradiar dicho fluido biológico sembrado antes o durante o antes y durante la irradiación con los microorganismos viables.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque adicionalmente incluye el control de la intensidad de una o más fuentes luminosas durante dicha irradiación para determinar una osis de irradiación.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la luz está en el rango UV.

8. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque dichos microorganismos consisten en virus de ácido nucleico monocatenario lineal o circular seleccionados de entre el grupo consistente en virus Parvoviridae, Parvovirus Canino (CPV) , Parvovirus Bovino (BPV) , Parvovirus Porcino (PPV) , Parvovirus Felino (FPV) , virus Circoviridae, virus Circinoviridae, virus Picornaviridae, Virus de la Encefalomiocarditis (EMV) , virus de ARN Enteroviridae, bacteriófagos de ADN Microviridae y bacteriófagos de ARN Leviviridae.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el reactor es un reactor de fotoinactivación por lotes con agitación.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, cuando dependen de la reivindicación 2, caracterizado porque dicho fluido biológico comprende al menos un aditivo para reducir daños y pérdida de actividad biológica de dicho fluido.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, cuando dependen de la reivindicación 2, caracterizado porque dicho método se lleva a cabo junto con al menos otro método de esterilización o de inactivación de microorganismos.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, cuando dependen de la reivindicación 2, caracterizado porque dicho método se lleva a cabo con un tratamiento con disolvente detergente.