Método para la detección y determinación de carga viral del virus del papiloma humano.

Un par de cebadores degenerados capaces de amplificar un fragmento del gen L1 de varios genotipos del virus del papiloma humano (VPH) y un método de detección y de cuantificación de la carga viral del VPH en muestras biológicas aisladas, que comprende: la extracción de ADN de una muestra biológica aislada, poner en contacto la muestra con una mezcla de reacción que contiene al menos un fluorocromo y los cebadores degenerados de la invención, amplificar un fragmento del gen L1 del VPH, medir la fluorescencia obtenida en el paso de amplificación y comparar el valor de fluorescencia obtenido con una secuencia control.

Método para la detección y determinación de carga viral del virus del papiloma humano.

La presente invención se encuadra en el campo de la biología molecular y de la medicina, y se refiere a un par de cebadores degenerados capaces de amplificar un fragmento del gen L1 de varios genotipos del virus del papiloma humano (VPH). También se refiere a un método de detección y de cuantificación de la carga viral del VPH en muestras biológicas aisladas. Además, la presente invención de refiere a un kit que comprende los cebadores mencionados y otros componentes para llevar a cabo dicho método.

Estado de la técnica anterior

La infección por virus del papiloma humano (VPH) es una de las causas principales de desarrollo de carcinoma de cuello uterino, además de ser el agente responsable de una de las enfermedades de transmisión sexual más frecuentes en el mundo. Se han descrito más de 120 tipos de VPH que se han clasificado desde el punto de vista oncogénico y filogenético en dos grupos, de alto y de bajo riesgo. Dentro de las especies de alto riesgo, algunas variantes del género Alfa-papilomavirus se consideran la causa directa del carcinoma de cérvix. Existen tres parámetros asociados al virus que son considerados de importancia en el desarrollo de cáncer: el genotipo viral, el estado del virus en la célula y la carga viral de ciertos tipos del virus como el VPH 16 o el VPH 58, cuyos valores se piensa que pueden ser de utilidad en el pronóstico del cáncer.

La introducción de métodos moleculares en el diagnóstico del VPH y la caracterización de las cepas han contribuido al conocimiento de la infección. En este sentido, existen varios métodos de detección del VPH. El más empleado es la detección de secuencias de ADN del virus, que se puede llevar a cabo, entre otras técnicas, mediante PCR.

La PCR presenta la ventaja de poder detectar, en una sola amplificación, varios genotipos del VPH si se amplifican regiones conservadas del virus, pero presenta el inconveniente de que, tras la amplificación, la tipificación viral se ha de realizar con sondas específicas para cada genotipo.

Los cebadores empleados en esta técnica de detección por PCR pueden ser específicos de cada cepa o universales o de amplio espectro. La PCR de tipo específico presenta el inconveniente de que para detectar diferentes genotipos del virus se han de realizar múltiples reacciones de PCR, por lo que la estandarización del método suele ser compleja. La PCR de amplio espectro suele estar diseñada para amplificar la región L1 del genoma del virus, por ser una de las más conservadas. Para llevar a cabo esta última se han diseñado diversos cebadores. En primer lugar, los que incluyen varias parejas de cebadores que contienen una o más posiciones degeneradas, como es el caso del sistema MY09/MY11 (Karin Biedermann et al., 2004, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 42, No. 8: 3758-3765). No obstante, dado el gran tamaño del producto de su amplificación (450 pares de bases), en los casos en los que se dispone de ADNs de mala calidad la amplificación se ve muy limitada. Por este motivo, en base a esta misma diana L1, se han realizado sucesivas modificaciones de la técnica que han pretendido sustituir MY09/MY11 por un conjunto de cebadores. Dentro de estos nuevos cebadores se encuentran los cebadores Primer General (GP) 5+/6+, diseñados sobre regiones conservadas pero que sólo hibridan completamente con algunos tipos de VPH (Markus Schmitt et al., 2008, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 46, No. 3: 1050-1059). Otra aproximación consiste en combinar una serie de parejas de cebadores diferentes que se unen a las mismas posiciones del genoma y que a menudo contienen inosina en sus secuencias. Ejemplos de este tipo de cebadores son PGMY y SPF (François Coutlée et al., 2002, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 40, No. 3: 902-907).

Existen sistemas de PCR de amplio espectro basados en el diseño de cebadores para otras regiones del genoma, como E1, aunque su uso no se ha generalizado en los laboratorios y es necesario incluir, adicionalmente, cebadores específicos junto con los degenerados en las mezclas de reacción (Agnetha Josefsson et al., 1999, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 37, No. 3: 490-496).

En todos los sistemas de detección basados en PCR con cebadores degenerados, la eficiencia de amplificación de los diversos genotipos no es igual sino que depende del grado de identidad de la secuencia del VPH y del cebador. Asimismo, en muestras con múltiples genotipos de VPH, la amplificación de los mismos depende de la carga viral de cada uno de ellos, pudiendo quedar enmascarados aquellos con cargas virales bajas (Silvia de Sanjosé Llongueras et al., 2006, 4º Monografía de la Sociedad Española de Epidemiología).

La técnica de PCR en tiempo real (Q-PCR) se ha introducido en los últimos años en el diagnóstico molecular del VPH como herramienta para la determinación cuantitativa de la carga viral, así como para el diagnóstico de la infección. La detección en tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble o mediante hibridación con diferentes tipos de sondas. La utilización de sondas mejora la especificidad de la reacción, sin embargo, la identificación de los diversos genotipos del VPH mediante esta técnica es compleja, ya que requiere la especificidad genotípica de las sondas empleadas. Varios sistemas basados en esta tecnología están o estarán disponibles en el mercado, si bien es necesaria una validación adecuada de los mismos.

Tanto los sistemas de amplificación del VPH de amplio espectro como los sistemas específicos de genotipo han sido adaptados a PCR en tiempo real. Así, se han desarrollado procedimientos de Q-PCR con sondas Taqman para detectar y cuantificar diferentes tipos de VPH, basados en la actividad 5'exonucleasa de la polimerasa Taq (Martin Moberg et al., 2003, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 41, No. 7: 3221-3228). Este método permite estimar la carga viral de los genotipos más frecuentes de VPH, sin embargo, cada reacción incluye un conjunto de cebadores y de sondas específicas, por lo que es necesaria la aplicación de un software capaz de detectar diferentes fluorocromos en la misma reacción de PCR. Además, la cantidad de genotipos virales que se pueden detectar mediante este sistema depende del número de sondas específicas que se incluyan en la reacción.

Otro tipo de Q-PCR empleada para la cuantificación de carga viral es la basada en SYBR Green. Uno de los ensayos realizados en este sentido utiliza el par de cebadores universales MY11/MY09, junto con pares de cebadores específicos, para detectar y cuantificar VPH 16 y 18 (Karin Biedermann et al., 2004, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 42, No. 8: 3758-3765). Por lo tanto, la utilización de estos dos cebadores degenerados requiere adicionalmente un conjunto de cebadores específicos para poder llevar a cabo la amplificación y cuantificación. Además, las técnicas basadas en este tipo de reacciones de Q-PCR SYBR Green normalmente consisten en una primera reacción de PCR convencional que permite la detección cualitativa del virus y posteriormente una PCR con cebadores específicos de genotipo para su detección cuantitativa.

Por otro lado, se han empleado cebadores fluorescentes unidos a sondas, los denominados cebadores Scorpions, para estimar la carga viral de VPH en una técnica que se conoce como VESPA (Keith W. Hart et al., 2001, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 39, No. 9: 3204-3212). La carga viral por célula se determina mediante la cuantificación de un gen control. El principal inconveniente que presenta este sistema es que las secuencias de los cebadores son específicas de cada genotipo. Por ello, para ampliar el espectro de genotipos virales que pueden reconocer estos cebadores, se ha diseñado una mezcla de cebadores Scorpions degenerados. No obstante, ello requiere un procedimiento de dos pasos consistente en una primera amplificación para insertar una secuencia consenso en el fragmento amplificado, que proporciona una diana única de reconocimiento, y una segunda reacción donde el cebador Scorpion reconoce dicha secuencia independientemente del tipo viral que la porte.

Los métodos existentes para llevar a cabo una determinación de la carga viral de VPH requieren el empleo de conjuntos de cebadores, específicos y/o degenerados, y en algunos...

1. Método de detección y cuantificación de la carga viral del VPH, que comprende: