La presente invención es un método para la identificación de las especies de almejas Ruditapes decussatus (almeja fina),

Ruditapes phillipinarum (almeja japonesa), Venerupis pullastra (almeja babosa), Venerupis rhomboides (almeja rubia) y Venerupis aurea (almeja dorada), que comprende aislar el ADN presente en una muestra de almeja, amplificar secuencias nucleotídicas de ADN ribosómico 5S mediante la reacción en cadena de la polimerasa y detectar las secuencias nucleotídicas amplificadas.

MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE ADN RIBOSÓMICO 55 DE ESPECIES DE

ALMEJA

SECTOR DE LA TÉCNICA

El método de la invención se encuadra dentro del sector de la identificación de especies comerciales de almejas a partir de técnicas moleculares. El método tiene aplicación en el sector alimentario, concretamente en el sector pesquero y conservero, para evitar el fraude comercial por sustitución de una especie determinada de almeja por otra más barata.

ANTECEDENTES

La producción media de almejas en toda Europa es de 60.000 toneladas anuales, siendo España el segundo país productor de almeja en Europa, y Galicia produce más de la mitad de las almejas que se comercializan en España, excluyendo las procedentes de importación. En Europa, la almeja japonesa Ruditapes philippinarum es la que presenta una mayor producción, seguida muy de lejos por la almeja fina Ruditapes decussatus y por la almeja babosa Venerupis pullastra. En España también se comercializan otras dos especies de almeja, la almeja rubia Venerupis rhomboides y la almeja dorada Venerupis aurea. Existe una diferencia en precio entre las distintas especies de almeja: el precio medio alcanzado por la almeja fina en España en el año 2009 fue de 19, 24 ?/kg, el de la almeja babosa 12, 39 ?/kg, y el de la japonesa 6, 90 ?/kg. La almeja rubia y la almeja dorada son las almejas que tienen un precio más bajo.

La identificación de las especies de almeja se puede realizar mediante métodos morfológicos, pero estos métodos no se pueden aplicar a muestras procesadas, donde la mayoría de los caracteres morfológicos necesarios para la identificación de la especie han sido eliminados.

En la identificación de especies de moluscos se han empleado diversas metodologías como el análisis de las secuencias nucleotídicas, RAPO (amplificación al azar de ADN polimórfico) , PCR-RFLPs (polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción y PCR-SSCP (polimorfismo conformacional de cadena sencilla) .

Los métodos moleculares de análisis de proteínas y ADN del estado de la técnica se han utilizado para la identificación de especies de almejas comercializadas, pero ninguno de ellos incluye la identificación de la especie Venerupis aurea (almeja dorada) , pese a presentar esta especie una gran similitud con las almejas fina y babosa, ambas de mayor calidad comercial.

El documento más cercano del estado de la técnica es la patente ES2303460, en dicho documento se describe un método para identificación de especies de navajas comerciales mediante PCR y análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción de secuencias de ADN ribosómico 5S. El método de detección descrito en dicho documento incluye una digestión enzimática mediante enzimas de restricción y es, por tanto, distinto al método de la presente invención.

El problema que plantea la técnica es encontrar un método viable técnica y económicamente de diferenciar entre ellas las especies de almejas prevalentes en el mercado presentes en una única muestra alimentaria, incluyendo en el método a Venerupis aurea (almeja dorada) , especie que no ha sido incluida en ninguno de los métodos del estado de la técnica. Las otras cuatro especies que se detectan son Ruditapes decussatus (almeja fina) , Ruditapes phillipinarum (almeja japonesa) , Venerupis pullastra (almeja babosa) y Venerupis rhomboides (almeja rubia) . La solución que propone la presente invención es un experimento de amplificación por polimerasa de dicha única muestra alimentaria en presencia de un cocktail de cebadores sobre el ADN 5S ribosomal, de gran especificidad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El método consiste en la extracción del ADN de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados o envasados en conserva de distintas especies. De forma que una realización de la invención es que la muestra de almeja esté seleccionada entre el grupo compuesto por almejas frescas, conservadas en etanol, congeladas y en conserva.

El método de la invención detecta secuencias de ADN ribosómico 5S para la identificación de las distintas especies. De forma que una realización más es el método de la invención para identificar las especies seleccionadas de entre el grupo compuesto por Ruditapes decussatus (almeja fina) , Ruditapes phillipinarum (almeja japonesa) , Venerupis pullastra (almeja babosa) , Venerupis rhomboides (almeja rubia) y Venerupis aurea (almeja dorada) .

Tras la extracción del ADN, se amplifican distintas secuencias mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction) . La PCR permite obtener un gran número de copias de una secuencia de ADN particular presente en un número limitado de copias. En este método, se utiliza PCR multiplex, una PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. La amplificación por PCR multiplex en este método se lleva a cabo con un cebador común y cinco cebadores específicos desarrollados a partir de la secuencia del ADN ribosómico 5S de cada una de las cinco especies de almeja, generando fragmentos característicos para cada especie: la almeja fina amplifica un fragmento con un tamaño de 480 pb, la almeja japonesa un fragmento de entre 430-450 pb, la almeja babosa amplifica dos fragmentos de 300 y 360 pb, la almeja rubia un fragmento de 225 pb y la almeja dorada dos fragmentos de 500 y 550 pb. Pese a presentar en algunos casos más de una banda de amplificación, y en otros variaciones de tamaño en los productos amplificados, todo ello debido a las características de esta región genómica en almejas, los patrones observados y las diferencias en longitud de los fragmentos amplificados permiten diferenciar claramente entre las especies. Estos tamaños han sido amplificados de manera satisfactoria en ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados o envasados en conserva.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Patrón de amplificación de las especies analizadas empleando PCR multiplex. Se presentan los resultados de amplificación sobre ADN extraído de ejemplares de almeja dorada recogidos en la costa gallega (pocillos 2-4 ) , de almeja japonesa recogida en la costa gallega (pocillos 5 y 6) y en la costa mediterránea (pocillos 7 y 8) , de almeja fina procedente de la costa gallega (pocillos 9 y 1O) y de la costa mediterránea (pocillos 11 y 12) , de almeja babosa de la costa gallega (pocillos 13-15) y de almeja rubia de la costa gallega (pocillos 16-19) . Los pocillos 1 y 20 corresponden a marcadores de peso molecular.

Figura 2. Patrón de amplificación de muestra de identidad desconocida y comparación con muestras de identidad conocida. Se presentan los resultados de amplificación sobre ADN extraído de almejas enlatadas identificadas solamente como "almejas de las rías gallegas" (pocillos 1 al 6) junto con ejemplares de almeja japonesa (pocillos 8 y 9) , almeja rubia (pocillo 1 0) , almeja dorada (pocillo 11 ) , almeja fina (pocillo 12) y almeja babosa (pocillo 13) . El pocillo 7 corresponde al marcador de peso molecular y el pocillo 14 al control negativo.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Extracción de ADN a partir de muestras de almejas

1. Método para la detección de ADN ribosómico 5S de especies de almeja que comprende:

a) aislar el ADN presente en una muestra de almeja,

b) amplificar secuencias nucleotídicas mediante la reacción en cadena de la polimerasa sobre el ADN extraído en a) empleando una mezcla de cebadores que comprende los cebadores identificados por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 o su secuencia

complementaria,

c) detectar las secuencias nucleotídicas amplificadas como resultado de la citada reacción en cadena de la polimerasa.

2. Método según reivindicación 1, caracterizado por que la muestra de almeja se

selecciona de entre el grupo compuesto por almejas frescas, conservadas en 15 etanol, congeladas y en conserva.

3. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, para la identificación de las especies seleccionadas de entre el grupo compuesto por Ruditapes decussatus, Ruditapes phillipinarum, Venerupis pullastra, Venerupis rhomboides y Venerupis aurea.