Método para el genotipado de ratone hyh mutantes para la proteína a-SNAP.

La presente invención pertenece al campo del genotipado de mamíferos mutantes. En concreto se refiere a un método para el genotipado de ratos hyh mutantes para la proteína a-SNAP así como a un kit de genotipado para llevar a cabo dicho método y unos oligonucleótidos específicamente diseñados para ser utilizados en dicho método.

Método para el genotipado de ratones hyh mutantes para la proteína α-Snap.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo del genotipado de mamíferos mutantes en concreto se refiere a un método para el genotipado de ratones hyh mutantes para la proteína α-Snap así como a un kit de genotipado para llevar a cabo dicho método y unos oligonucleótidos específicamente diseñados para ser utilizados en dicho método.

Antecedentes de la invención

El ratón mutante hyh (hydrocephalus with hop gait), desarrolla una hidrocefalia congénita debido a una mutación autosómica recesiva localizada en el cromosoma 7 (Bronson and Lane, 1990). Las diferencias fenotípicas externas han servido hasta el momento para identificar al animal mutante, aunque los signos de hidrocefalia solo son apreciables a partir del nacimiento. Histológicamente se aprecian diferencias fenotípicas desde los 12 días de gestación, pero en edades anteriores son indistinguibles (Pérez-Fígares et al., 1998; 2001; Jiménez et al., 2001; Batiz et al., 2006).

La mutación que presentan los ratones hyh corresponde a una mutación puntual en el gen α-Snap (alpha soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein), que origina una sustitución de una guanina (G) por una adenina (A), lo que produce una sustitución de la metionina en la posición 105 por una isoleucina (M105I) en la proteína α-Snap (Chae et al., 2004; Hong et al., 2004). Esta es una posición altamente conservada a lo largo de la evolución en las distintas especies de mamíferos.

La proteína α-Snap interviene en el tráfico vesicular celular y en la fusión de las membranas vesicular y diana mediante la interacción con el factor sensible a la N-etilmaleimida (NSF), su ATP-asa, y el complejo SNARE, formado por t-SNARE y v-SNARE (Hong et al., 2004). α-Snap se expresa de forma constitutiva en todas las células del organismo y juega un papel muy importante en el tráfico intercompartimental de proteínas mediado por vesículas, incluyendo el transporte de proteínas de un compartimento celular a otro y hacia la membrana plasmática (Clary et al., 1990; Stenbeck, 1998) desempeñando por ello un papel fundamental en la polaridad celular. La alteración del tráfico vesicular hacia la membrana plasmática afecta al transporte de proteínas de adhesión y/o proteínas de la misma membrana celular.

Hasta el momento, el interés de esta cepa de ratones mutantes ha estado centrado exclusivamente en las investigaciones sobre las alteraciones neuropatológicas asociadas a la hidrocefalia congénita (Bronson and Lane, 1990; Pérez-Fígares et al., 1998; 2001; Jiménez et al., 2001; Wagner et al., 2003; Batiz et al., 2006) ya que es un buen modelo animal para estudiar la etiología de esta enfermedad en humanos (Domínguez-Pinos et al., 2005; Batiz et al., 2006). Sin embargo, a partir de los trabajos de Chae et al. (2004) y Hong et al. (2004), en los que se identifica a la proteína mutada, la cepa hyh se ha convertido en uno de los pocos modelos anímales para investigar fenómenos celulares tales como: i) tráfico vesicular (véase: Rothman and Warrent, 1994; Woodman, 1997; Nichols, 1998; Ungerma?n et al., 2005); ii) polaridad celular y biología de las células madre, por alteración de la división celular simétrica y asimétrica (véase: Ikonen et al., 1995; McDonald, 2004); iii) fertilidad por afectación de la reacción acrosomal (vease: Tomes et al., 2004; Sousa et al., 2006); vi) alteraciones corticales (véase: Chae et al., 2004); v) exocitosis (véase: Goda, 1997; Sollner, 2003) etc. Es más, una revisión reciente (Andreeva et al. 2006) propone a α-Snap como un futuro blanco terapéutico en patologías como diabetes, cáncer, y enfermedades del sistema nervioso central, y destaca la potencialidad del modelo hyh para aproximarse a esta problemática. En este contexto, es de esperar que el interés científico en el modelo hyh irá en aumento durante los próximos años.

Hasta el año 2004, los animales homocigotos para el gen mutado, solo se podían distinguir fenotípicamente por los rasgos hidrocefálícos (Bronson y Lane, 1990; Bátiz et al. 2006) e histológicamente por el denudamiento ependimario que presentan desde edades embrionarias (Pérez-Fígares et al., 1998; Jiménez et al., 2001). A partir del 2004, con la identificación del gen mutado, la identificación de los animales homocigotos ha sido posible únicamente mediante amplificación del fragmento que contiene la secuencia y secuenciación. Si bien, esta técnica permite genotipar los ratones hyh, exige (1) purificar los fragmentos de PCR y (2) secuenciar los productos obtenidos a partir de cada animal de experimentación, con lo cual los tiempos y costos se hacen poco apropiados.

Además, no ha sido posible genotipar a los ratones hyh por PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) debido a la ausencia de un enzima de restricción cuya diana permita diferenciar el alelo silvestre (snap+), del alelo mutado (snap-). Ante esta dificultad, y con el objetivo de genotipar a estos ratones, los autores de la presente invención han diseñado unos cebadores que no solo permiten amplificar una secuencia que incluye el locus de la mutación hyh sino que son capaces de crear un nuevo sitio de restricción en el fragmento amplificado a partir del alelo snap+, pero no en el amplificado a partir del snap-, lo cual permite distinguir entre los distintos genotipos (snap+/+; snap+/-; snap-/-) de una manera sencilla fiable y poco costosa.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: la figura representa como la base desapareada del cebador snap-forward permite crear una diana de restricción para el alelo snap+ (A) pero no para el alelo snap - (B). La presencia de dicha diana de restricción en los fragmentos amplificados a partir del alelo snap+ permite diferenciar los alelos snap+ y snap- mediante separación por tamaños en electroforesis tras digestión con la enzima de restricción.

Figura 2: Gel de agarosa en el que se aprecian los resultados del producto amplificado por PCR. La primera calle corresponde al marcador de pesos moleculares pUC 18 DNA Msp I Digest. La segunda corresponde a la amplificación a partir de DNA de un animal hidrocefálico (H), la tercera a la de un animal normal (N) y la cuarta a la de un heterocigoto (Het).

Figura 3: Gel de agarosa en el que se aprecian los resultados de la restricción con BspHI de los productos amplificados por PCR. La primera calle corresponde a la restricción de los fragmentos amplificados a partir de DNA de un animal hidrocefálico (H), la segunda a la de un animal normal (N), la tercera a un heterocigoto (Het), y la última calle corresponde al marcador de pesos moleculares pUC 18 DNA Msp I Digest.

Objeto de la invención

Un primer objeto de la invención es un método para el genotipado de ratones mutantes hyh para la proteína α-Snap basado en el uso de unos cebadores específicos capaces de crear una diana de restricción en el locus de la mutación en uno de los dos alelos, ya sea el alelo silvestre o el mutante, al ser amplificados.

Un segundo objeto de la invención consiste en un kit de genotipado para llevar a cabo el método de la invención. Los elementos fundamentales de este kit son los cebadores capaces de crear las dianas de restricción así como la enzima de restricción capaz de reconocer dicha diana y cortar los fragmentos que las posean.

Por último, son también objeto de la invención los oligonucleótidos con secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 cuyo uso como cebadores para PCR permite obtener un sitio nuevo de restricción para la enzima BspHI cuando se amplifica el alelo silvestre (snap+).

Descripción detallada de la invención

El primer aspecto de la invención se refiere a un método para el genotipado de ratones mutantes hyh para la proteína α-Snap que comprende:

a) amplificar en el ADN del ratón una secuencia que incluye el locus de la mutación hyh con unos cebadores diseñados para crear un nuevo sitio de restricción en dicho locus para el alelo silvestre o para el alelo mutado.

b) someter el producto de amplificación de a) a digestión con la enzima de restricción para la cual se ha creado supuestamente el sitio de restricción.

1. Método para el genotipado de ratones mutantes hyh para la proteína α-Snap que comprende: