MÉTODO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD DE TRANSPORTE DE UNA PROTEÍNA DE TRANSPORTE.

Método para determinar la actividad de transporte de una proteína de transporte ABC,

caracterizado porque el método comprende:

- mezclar:

(i) una vesícula dentro-fuera ("inside-out") que porta por lo menos una proteína de transporte ABC de un modo en el que el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte se encuentra en el exterior de la vesícula con:

(ii) una perla de ensayo de centelleo por proximidad (SPA) adecuada para la unión directa o indirecta al extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte con:

(iii) (únicamente en el caso de la unión indirecta de una perla de SPA con el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte) por lo menos una molécula que pueda mediar en la unión de la perla de SPA con el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte (es decir, de entre 1 y, como máximo, 25 aminoácidos) con:

(iv) un sustrato marcado radioactivamente que puede ser transportado por la proteína de transporte bajo condiciones que permiten el transporte del sustrato, en presencia de ATP, e

- incubar la mezcla durante por lo menos 30 segundos para permitir la unión directa o indirecta de las vesículas a la perla de SPA y para permitir el transporte de sustrato al interior de la vesícula, y

- medir la luz emitida por el líquido de centelleo de la perla.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/058473.

Solicitante: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: BINGER STRASSE 173 55216 INGELHEIM AM RHEIN ALEMANIA.

Inventor/es: CUI,Yunhai.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 15 de Agosto de 2007.

Clasificación PCT:

  • G01N33/542 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › con inhibición estérica o modificación de la señal, p. ej. extinción de fluorescencia.
  • G01N33/60 G01N 33/00 […] › en los que intervienen sustancias marcadas radioactivas.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2372317_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para determinar la actividad de transporte de una proteína de transporte Las proteínas de transporte son proteínas membranales que regulan la permeabilidad selectiva de las membranas biológicas, tales como la membrana citoplasmática o las membranas subcelulares. Las proteínas de transporte permiten el movimiento pasivo de solutos a través de la membrana bajando por sus gradientes electroquímicos (transportadores pasivos) o median en la acumulación de solutos frente a sus gradientes de concentración mediante el consumo directo o indirecto de la energía proporcionada por la hidrólisis del ATP (transportadores activos). Una de las familias más grandes de transportadores activos son los transportadores de casete de unión a ATP (transportadores ABC) (Higgins, 1992; Holland y Holland, 2005). En el ser humano, los transportadores ABC desempeñan importantes funciones en una amplia variedad de procesos fisiológicos y fisiopatológicos. Las mutaciones en los genes codificantes de los transportadores ABC resultan en diversas enfermedades genéticas, entre ellas la fibrosis quística (Riordan et al., 1989), la enfermedad de Tangier (Bodzioch et al., 1999; Brooks-Wilson et al., 1999; Young y Fielding, 1999), el síndrome de Dubin-Johnson (Kartenbeck et al., 1996; Mayer et al., 1995), pseudoxantoma elástico (Ringpfeil et al., 2000) y la enfermedad de Stargardt (Allikmets, 1997). Aparte de sus funciones fisiológicas, los transportadores ABC también desempeñan importantes funciones en el proceso de absorción, disposición y eliminación de fármacos (Ayrton y Morgan, 2001; Borst y Elferink, 2002). La sobreexpresión de los transportadores ABC en las células tumorales es un mecanismo importante de su resistencia a los fármacos quimioterapéuticos (Gottesman et al., 2002). Por lo tanto, la investigación sobre la interacción en fármacos y transportadores ABC es indispensable para el desarrollo con éxito de los candidatos farmacológicos. Debido a la importante función de las proteínas de transporte existe una necesidad de sustancias que puedan modular la actividad de las mismas. Para identificar dicha sustancia, existe una necesidad de, por ejemplo, un ensayo compatible de alto o ultraalto rendimiento que sea suficientemente sensible para determinar si una sustancia puede modular la actividad de las proteínas de transporte. En la actualidad, únicamente se conocen en la técnica métodos costosos y largos que comprenden varias etapas para determinar únicamente la actividad de transporte de una proteína de transporte, lo que es el método de base para determinar si una sustancia puede modular la actividad de una proteína de transporte, por ejemplo Williams et al., 2003, en donde se da a conocer un método en el que se utilizan células completas para medir la actividad de transporte de incorporación. Un método típico para determinar la actividad de una proteína de transporte conocido de la técnica es, por ejemplo, un método de filtración rápida en el que se mide la actividad de transporte de una proteína de transporte del modo siguiente: - se proporcionan vesículas membranales preparadas a partir de tejidos, células en cultivo o células que expresan una proteína de transporte recombinante, - se incuban dichas vesículas durante un periodo de tiempo dado con un sustrato de marcaje radioactivo bajo condiciones que permitan el transporte del sustrato, - se separan las vesículas membranales del sustrato extravesicular mediante filtración a través de, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa o de fibra de vidrio, y - se mide, por ejemplo, el incremento de radioactividad de las vesículas separadas, en las que el nivel de radioactividad se correlaciona directamente con la actividad de transporte de la proteína de transporte (Keppler et al., 1998). Aparte de la larga etapa de separación de dicho método, una desventaja adicional del mismo es que no resulta adecuado para las campañas de cribado de alto rendimiento (HTS) y en particular parte las campañas de cribado de ultra-alto rendimiento (uHTS). La patente WO nº 2005/C54852 da a conocer un ensayo que utiliza tecnología SPA, que es bien conocida para la utilización en los HTS. Sin embargo, dicha tecnología SPA da a conocer resulta adecuada únicamente para las proteínas transportadoras de incorporación. Tal como se ha descrito de manera general anteriormente, los usos de las proteínas de transporte para el perfilado de sustancias durante el desarrollo de una sustancia farmacéutica están adquiriendo una importancia creciente. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de proporcionar un nuevo método rápido para determinar la actividad de transporte de una proteína de transporte de exportación que también resulte adecuado para la utilización en campañas de HTS. Descripción de la invención Aunque las proteínas de transporte y su aplicabilidad al perfilado de sustancias putativas y, de esta manera, la necesidad de métodos para determinar la actividad de una proteína de transporte respectiva, se han conocido desde hace años, hasta hoy sólo se han conocido métodos largos para determinar la actividad de transporte de una 2   proteína de transporte que comprenden una etapa de filtración fuera de la probeta en la que debe separarse el sustrato marcado respecto de la mezcla de reacción antes de obtener la correspondiente lectura, o métodos restringidos a proteínas transportadoras de incorporación. Sin embargo, la presente invención proporciona por primera vez un "método en un solo tubo", que proporciona un método rápido y menos generador de residuos para determinar la actividad de transporte de una proteína de transporte ABC (proteína de transporte de exportación), que además resulta adecuada en las campañas de HTS, así como de uHTS. Uno de los fundamentos de para la presente invención es el resultado de que puede marcarse un segmento muy próximo al extremo C-terminal, es decir 1 a 25 aminoácidos de una proteína de transporte ABC, por ejemplo con una etiqueta de histidina (Hagmann et al., 1999) y/o dirigirse, por ejemplo con un anticuerpo o fragmento del mismo, sin perder su actividad de transporte. De esta manera, puede utilizarse el mismo extremo Cterminal como anclaje en un ensayo para determinar la actividad de dicha proteína de transporte. Un fundamento adicional es una técnica de ensayo homogénea y genérica bien conocida denominada técnica de centelleo por proximidad (SPA), que se remonta, por ejemplo, a 1979 (Hart y Greenwald, Mol. Immunology 16:265- 267, 1979). Puede utilizarse la SPA para medir la radioactividad mediante la proximidad de la radioactividad a un líquido de centelleo que puede ser estimulado a emitir luz que puede detectarse en contadores de centelleo estándares. Al desintegrarse un átomo radioactivo, libera partículas subatómicas, tales como electrones. La distancia a la que viajarán estas partículas dentro de agua es limitada y depende de la energía de la partícula. La SPA se basa en esta limitación. Por ejemplo, al desintegrarse un átomo de tritio, [ 3 H], libera una partícula ß. En el caso de que el átomo de [ 3 H] se encuentre a menos de 1,5 m de una molécula de líquido de centelleo adecuada, la energía de la partícula ß será suficiente para alcanzar el líquido de centelleo y excitarlo para que emita luz. En el caso de que la distancia entre el líquido de centelleo y el átomo de [ 3 H] sea superior a 1,5 m, las partículas ß no presentarán suficiente energía para viajar las distancias necesarias. En una solución acuosa, las colisiones con las moléculas de agua disipan la energía de las partículas ß y por lo tanto no pueden estimular el líquido de centelleo. Preferentemente, el líquido de centelleo se incorpora en pequeñas fluoromicroesferas (perlas) que son bien conocidas de la técnica. Se construyen para unirse a moléculas específicas (por ejemplo recubiertas con proteína A para unirse a una inmunoglobulina). En el caso de que una molécula radioactiva se una a una perla, se encontrará suficientemente próxima para que pueda estimular al líquido de centelleo para que emita luz (longitud de onda de entre 350 y 650 nm) que puede detectarse en contadores de centelleo estándares como TopCount (Perkin Elmer) o LEADSeeker (GE). La presente invención proporciona por primera vez un ensayo de SPA para determinar la actividad de una proteína de transporte ABC en la que el mismo extremo C-terminal de una proteína de transporte se utiliza como puente para proporcionar proximidad a una perla de SPA. Un método de la presente invención para determinar la actividad de transporte de una proteína de transporte ABC se caracteriza porque el método comprende: - mezclar: (i) una vesícula dentro-fuera ("inside-out") que porta por lo menos una proteína de transporte ABC de un modo en el que el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte se... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para determinar la actividad de transporte de una proteína de transporte ABC, caracterizado porque el método comprende: - mezclar: (i) una vesícula dentro-fuera ("inside-out") que porta por lo menos una proteína de transporte ABC de un modo en el que el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte se encuentra en el exterior de la vesícula con: (ii) una perla de ensayo de centelleo por proximidad (SPA) adecuada para la unión directa o indirecta al extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte con: (iii) (únicamente en el caso de la unión indirecta de una perla de SPA con el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte) por lo menos una molécula que pueda mediar en la unión de la perla de SPA con el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte (es decir, de entre 1 y, como máximo, 25 aminoácidos) con: (iv) un sustrato marcado radioactivamente que puede ser transportado por la proteína de transporte bajo condiciones que permiten el transporte del sustrato, en presencia de ATP, e - incubar la mezcla durante por lo menos 30 segundos para permitir la unión directa o indirecta de las vesículas a la perla de SPA y para permitir el transporte de sustrato al interior de la vesícula, y - medir la luz emitida por el líquido de centelleo de la perla. 2. Método según la reivindicación 1, en el que la proteína de transporte se selecciona de entre un grupo que consiste de MRP1 (ABCC1), MRP2 (ABCC2), MRP3 (ABCC3), MRP4 (ABCC4), MRP5 (ABCC5), MRP6 (ABCC6), MRP7 (ABCC10), MRP8 (ABCC11), SUR1 (ABCC8), SUR2 (ABCC9), CFTR (ABCC7), ABCA1, ABCA3, ABCA4, ABCG5, ABCG8, MDR1 (ABCB1), MDR3 (ABCB4), BSEP (ABCB11), BCRP (ABCG2), TAP1 (ABCB2) y TAP2 (ABCB3). 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el sustrato se selecciona de entre un grupo que consiste de ADP, BQ-123, colesterol, cimetidina, colchicina, AMP cíclico, GMP cíclico, sulfato de deshidroepiandrosterona, daunomicina, digoxina, glucurónido de estradiol, estrona-3-sulfato, etopósido, ácido fólico, glucosilceramida, glucoquenodesoxicolato, glicocolato, leucotrieno C4, leucotrieno D4, leucotrieno E4, metotrexato, mitoxantona, sulfobromoftaleína, paclitaxel, factor activador de plaquetas, prostaglandina E1, prostaglandina E2, prostaglandina F2-alfa, ritonavir, saquinavir, tromboxano B2, verapamil, sitosterol, tauroquenodesoxicolato, taurocolato, tauroursodesoxicolato, prazosina, vincristina y vinblastina. 4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que como proteína de transporte y como sustrato se utiliza una de las combinaciones siguientes: proteína de transporte/acrónimo del gen: sustrato MRP1 / ABCC1 : leucotrieno C4, leucotrieno D4, leucotrieno E4, glucurónido de estradiol, ácido fólico o metotrexato; MRP2 / ABCC2 : leucotrieno C4, glucurónido de estradiol, ácido fólico, metotrexato o sulfobromoftaleína; MRP3 / ABCC3 : leucotrieno C4, glucurónido de estradiol, ácido fólico, metotrexato o glicocolato; MRP4 / ABCC4 : leucotrieno C4, glucurónido de estradiol, estrona-3-sulfato, sulfato de deshidroepiandrosterona, ácido fólico, GMPc, AMPc, ADP, metotrexato, prostaglandina E1, prostaglandina E2, prostaglandina F2-alfa o tromboxano B2; MRP5 / ABCC5 : ácido fólico, GMPc, AMPc, metotrexato, 5-fluoro-2'-desoxiuridina 5'monofosfato,monofosfato; 5-fluorouridina 5'-monofosfato ó 2'-desoxiuridina 5'- MRP6 / ABCC6 : leucotrieno C4 ó BQ-123; CFTR / ABCC7 : cloruro; MRP7 / ABCC10 : leucotrieno C4 ó glucurónido de estradiol; MRP8 / ABCC11 : AMPc, GMPc, leucotrieno C4, glucurónido de estradiol, estrona-3-sulfato, sulfato de deshidroepiandrosterona, taurocolato o glicocolato; MDR1 / ABCB1 : glucosilceramida, factor activador de plaquetas, daunomicina, digoxina, colchicina, etopósido, paclitaxel, verapamil, vincristina, vinblastina, ritonavir o saquinavir; 14   BSEP / ABCB11 : taurocolato, glicocolato, tauroquenodesoxicolato, glicoquenodesoxicolato o tauroursodesoxicolato; ABCA4 : retinal; BCRP / ABCG2 : estrona-3-sulfato, glucurónido de estradiol, ácido fólico, metotrexato, mitoxantona, topotecán o cimetidina; ABCG5 : colesterol o sitosterol; ABCG8 : colesterol o sitosterol. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el periodo de incubación es de por lo menos 30 segundos y no es superior a 30 horas. 6. Método para medir la actividad de transporte de una proteína de transporte en un formato de alto rendimiento (HTS), caracterizado porque se lleva a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que se utilizó MRP4 como proteína de transporte. 8. Método según la reivindicación 7, en el que, en (iii) del método según la reivindicación 1, se utiliza un anticuerpo que puede unirse a un péptido la secuencia del cual se proporciona en SEC ID nº 1 ó nº 2. 9. Método según la reivindicación 7 ó 8, en el que, en (ii) del método según la reivindicación 1, se utiliza una perla de SPA que ha sido recubierta con proteína A. 10. Método según la reivindicación 7 ó 8, en el que, en (ii) del método según la reivindicación 1, se utiliza una perla de SPA que ha sido recubierta con un anticuerpo adicional que puede unirse al anticuerpo según la reivindicación 8. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se utiliza MRP4 como proteína de transporte a la que se ha fusionado C-terminalmente una etiqueta de histidina. 12. Método según la reivindicación 11, en el que se utiliza MRP4 como proteína de transporte a la que se ha unido una etiqueta histidina de por lo menos 6 residuos de histidina. 13. Método según la reivindicación 11 ó 12, en el que, en (ii) del método según la reivindicación 1, se utiliza una perla de SPA que ha sido recubierta con quelato de cobre. 14. Método para determinar si un compuesto es un modulador de la actividad de transporte de una proteína de transporte ABC, caracterizado porque el método comprende: - mezclar: (A) (i) una vesícula dentro-fuera ("inside-out") que porta por lo menos una proteína de transporte ABC de un modo en el que el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte se encuentra en el exterior de la vesícula, con: (ii) una perla de ensayo de centelleo por proximidad (SPA) adecuada para la unión directa o indirecta al extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte, con: (iii) (únicamente en el caso de la unión indirecta de una perla de SPA con el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte) por lo menos una molécula que pueda mediar en la unión de la perla de SPA con el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte, es decir, de entre 1 y, como máximo, 25 aminoácidos, con: (iv) un sustrato marcado radioactivamente que puede ser transportado por la proteína de transporte bajo condiciones que permiten el transporte del sustrato, en presencia de ATP, con: (v) un compuesto que debe someterse a ensayo, y mezclar: (B) (i) una vesícula que porta por lo menos una proteína de transporte de un modo en el que el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte se encuentra en el exterior de la vesícula con: (ii) una perla de SPA adecuada para la unión directa o indirecta al extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte con: (iii) (únicamente en el caso de la unión indirecta de una perla de SPA con el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte) por lo menos una molécula que pueda mediar en la unión de la perla de SPA con el extremo C-terminal mismo de la proteína de transporte, es decir, de entre 1 y, como máximo, 25 aminoácidos, con:   (iv) un sustrato marcado radioactivamente que puede ser transportado por la proteína de transporte bajo condiciones que permiten el transporte del sustrato (es decir, en presencia de ATP), y - incubar las mezclas (A) y (B) durante un periodo de tiempo suficiente, por lo menos 30 segundos, para permitir la unión directa o indirecta de las vesículas con la perla de SPA y para permitir el transporte de sustrato al interior de la vesícula, y - medir la luz emitida por el líquido de centelleo de la perla, en donde el valor incrementado obtenido con (A), en comparación con (B), identifica un compuesto que es un activador de la proteína de transporte sometida a ensayo, y un valor reducido obtenido con (A), en comparación con (B), identifica un compuesto que es un inhibidor de la proteína de transporte sometida a ensayo. 16

 

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