Un método para detectar o cuantificar ADN de trigo endógeno en una muestra de ensayo usando PCR,

que comprende: una etapa de amplificación de un ácido nucleico de una región que comprende al menos un 80% o más de una secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO:1 o la SEC ID NO:2, usando un ácido nucleico en dicha muestra o ácido nucleico extraído de dicha muestra como molde con un par cebador capaz de amplificar dicha región, y detectar o cuantificar el ácido nucleico amplificado

Método para detectar y cuantificar una secuencia de ADN de trigo endógeno.

ANTECEDENTES

La presente invención se refiere a un método para detectar o cuantificar una secuencia de ADN endógeno de trigo en una muestra de ensayo, y se refiere en particular a un método de detección o cuantificación de ADN de trigo endógeno para usar cuando se determina la tasa de contaminación de trigo modificado genéticamente contenido en materiales alimentarios o alimentos procesados.

En Japón, 50 o más variedades de cultivos modificados genéticamente (de aquí en adelante “OMG”) , incluyendo maíz, soja y patatas, han pasado la valoración de seguridad y se han aprobado para importación y venta. Al mismo tiempo, los alimentos que contienen OMG deben etiquetarse como tales de acuerdo con las “Normas de etiquetado para alimentos modificados genéticamente” establecidas por el Ministerio de agricultura, bosques y pesca basado en el artículo 7, párrafo 1 de las “Normas de calidad de etiquetado para alimentos procesados” y el artículo 7, párrafo 1 de las “Normas de calidad de etiquetado para alimentos frescos” (notificación nº 517 del Ministerio de agricultura, bosques y pesca, 31 de marzo de 2000) , y la “Aplicación de la ordenanza ministerial que corrige en parte la ordenanza ministerial sobre la aplicación de la ley de sanidad alimentaria, reglamentos y patrones composicionales, etc. para leches y productos lácteos” (Notificación nº 79 del Departamento de sanidad alimentaria, Ministerio de sanidad, trabajo y bienestar, 15 de marzo de 2001) .

Sin embargo, en otros países, los OMG pueden cultivarse en algunos casos conjuntamente con no OMG una vez se ha completado la evaluación de la seguridad, o puede aparecer contaminación durante el proceso de distribución después de la recolección. Además, los fabricantes de productos alimentarios y similares a menudo subcontratan la fabricación de alimentos procesados en compañías de fabricación, e incluso si estipulan que deben usarse no OMG, si se usan OMG en las plantas de las compañías de fabricación, los alimentos procesados pueden contaminarse por pequeñas cantidades de OMG. En consecuencia, para satisfacer sus obligaciones de etiquetado de productos alimentarios y similares, los productores deben valorar y analizar los productos alimentarios procesados finales para verificar que no están contaminados con OMG.

Los métodos para detectar OMG en muestras de ensayo de alimentos procesados y sus materiales brutos, etc. incluyen métodos de detección de ADN modificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y métodos de detección de proteínas modificadas por ELISA, pero en el caso de alimentos procesados, los OMG deben detectarse por PCR debido a que las proteínas a menudo se han desnaturalizado por el calor o la presión y no pueden detectarse exactamente por ELISA.

Los métodos de valoración y análisis incluyen los métodos descritos en el “JAS Analytical Handbook, Manual of Assessment and Analysis for Genetically Modified Foods”, 2ª edición revisada, y los descritos en “Concerning Testing Methods for Foods Modified by Recombinant DNA Technology (revisado parcialmente) ” (Notificación nº 0618002 del Departamento de sanidad alimentaria, Ministerio de salud, trabajo y bienestar, 18 de junio de 2003) . Estos describen que, en el ensayo y análisis de OMG, es necesario efectuar la PCR usando un par cebador que reconozca el ADN endógeno de cada producto agrícola y verificar que se obtiene un producto de PCR de la longitud esperada, para verificar que el ADN extraído de la muestra de ensayo puede amplificarse mediante PCR. Cuando se cuantifica un OMG contenido en una muestra de ensayo, se usa el método de medir la tasa de mezclado del cultivo modificado basándose en la relación de ADN recombinante a ADN endógeno que está siempre presente en ese cultivo.

En el caso del maíz, por ejemplo, se han desarrollado pares cebadores que reconocen cada una de las 5 estirpes de OMG aprobados, junto con un par cebador que reconoce la región génica SSIIB de ADN de maíz endógeno (“JAS Analytical Handbook, Manual of Assessment and Analysis for Genetically Modified Foods”, 2ª edición revisada, IAA Center for Food Quality, Labeling and Consumer Services) . Debido a que este par cebador proporciona el patrón de la cantidad de ADN endógeno en la detección y cuantificación del ADN recombinante, la región de ADN endógeno a amplificar debería estar presente en una sola copia del genoma.

En “Concerning Testing Methods for Foods Modified by Recombinant DNA Technology (revisado parcialmente) ” (notificación nº 1113001 del Departamento de sanidad alimentaria, Ministerio de salud, trabajo y bienestar, 13 de noviembre de 2003) , los productos de amplificación por pares cebadores específicos orientados a ADN de maíz o soja endógeno y a ADN recombinante están ligados con un plásmido y se usan como sustancia patrón. La relación del número de copias de ADN recombinante a número de copias de ADN endógeno puede determinarse exactamente en una muestra de ensayo mediante PCR cuantitativa de tiempo fijo, efectuando la PCR usando esta sustancia patrón.

Cuando hay múltiples estirpes de OMG como en el caso del maíz, es una técnica particularmente útil usar una sustancia patrón común para medir la tasa de contaminación de cada estirpe, lo que puede realizarse usando una sustancia patrón que tiene ADN endógeno y ADN específico de cada estirpe incorporados a un solo ADN circular.

Es generalmente difícil obtener genes específicos de cada estirpe, pero una vez se han incorporado estos al ADN circular, es posible proporcionar un suministro estable de ADN específico de estirpe replicando el ADN circular mismo.

SUMARIO

Aunque ningún producto modificado genéticamente del trigo común (Triticum aestivum, de aquí en adelante llamado a veces simplemente “trigo”) ha pasado todavía la valoración de seguridad, se espera que aparezcan en el mercado en el futuro próximo. En consecuencia, tienen que desarrollarse métodos para detectar y cuantificar ADN de trigo endógeno y pares cebadores de PCR para uso en dichos métodos en preparación para la distribución de trigo OMG. En términos de su estructura genómica y la secuencia nucleotídica de sus genes, sin embargo, el trigo comparte un alto grado de homología con otros cereales tales como cebada, centeno y avena. Además del trigo común (Triticum aestivum) , existe también el trigo duro (Triticum durum) . El trigo duro comparte un grado particularmente alto de homología con el trigo común, puesto que posee las partes (AA, BB) del genoma del trigo común (AA, BB, DD) , de modo que la posibilidad de una falsa detección es alta. Existe por lo tanto la necesidad de métodos capaces de detectar específicamente el ADN endógeno de trigo común sin detectar falsamente ADN derivado de trigo duro y otros cultivos de cereales, o en otras palabras, de métodos que eviten una reacción cruzada con otros cultivos.

Cuando hay múltiples copias de una región de ADN endógeno amplificada por PCR, el trigo de la muestra de ensayo no puede ensayarse exactamente, así que para ensayar exactamente la tasa de contaminación del trigo OMG en la muestra de ensayo es deseable que la región de ADN endógeno para amplificar esté presente solo en una sola copia en el genoma.

Además, cuando se valora la contaminación de OMG por PCR cuantitativa, es también útil en el caso del trigo usar una sustancia patrón que comprenda una región capaz de amplificarse por pares cebadores específicos orientados a ADN génico endógeno y ADN recombinante ligados a ADN circular.

Es por lo tanto objeto de la presente invención especificar una secuencia parcial de ADN de trigo (genoma) que esté presente en una sola copia y permita la detección específica de trigo sin reactividad cruzada con otras plantas en PCR, y proporcionar cebadores para amplificar esta secuencia parcial y un método para detectar y ensayar favorablemente el ADN endógeno usando estos cebadores.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una sustancia patrón que comprenda una región capaz de amplificarse por pares cebadores específicos orientados a ADN génico endógeno y ADN recombinante ligados a ADN circular.

Los inventores perfeccionaron en este caso la presente invención como resultado de una investigación exhaustiva dirigida a resolver los problemas anteriormente mencionados, cuando encontraron que... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar o cuantificar ADN de trigo endógeno en una muestra de ensayo usando PCR, que comprende:

una etapa de amplificación de un ácido nucleico de una región que comprende al menos un 80% o más de una secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO:1 o la SEC ID NO:2, usando un ácido nucleico en dicha muestra o ácido nucleico extraído de dicha muestra como molde con un par cebador capaz de amplificar dicha región, y detectar o cuantificar el ácido nucleico amplificado.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el par cebador se selecciona del grupo consistente en:

(i) un par cebador consistente en un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO:8 y un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO:9,

(ii) un par cebador consistente en un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO:10 y un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO: 11, y

(iii) pares cebadores consistentes en pares de ácidos nucleicos que comprenden cada uno la secuencia continua de al menos un 80% de la secuencia nucleotídica de un ácido nucleico del par cebador (i) o (ii) .

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que los cebadores en el par cebador son ácidos nucleicos de 15 a 40 nucleótidos de longitud.

4. Un par cebador para detectar o cuantificar trigo en una muestra de ensayo por PCR, en el que dicho par cebador es capaz de amplificar una región consistente en al menos un 80% de una secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO:1 o la SEC ID NO:2.

5. El par cebador según la reivindicación 4, seleccionado del grupo consistente en:

(i) un par cebador consistente en un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO:8 y un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO:9,

(ii) un par cebador consistente en un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO:10 y un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO: 11, y

(iii) pares cebadores consistentes en pares de ácidos nucleicos que comprenden cada uno la secuencia continua de al menos un 80% de la secuencia nucleotídica de un ácido nucleico del par cebador (i) o (ii) .

6. Un kit para la detección o ensayo de una secuencia de ADN de trigo endógeno en una muestra de ensayo por PCR, que comprende un par cebador según la reivindicación 4 o 5.

7. Un ADN circular que comprende una región consistente en al menos un 80% de una secuencia nucleotídica representada por la SEC ID NO:1 o la SEC ID NO:2, capaz de amplificarse por PCR usando un par cebador según la reivindicación 4 o 5.

8. El ADN circular según la reivindicación 7, que comprende adicionalmente uno o más trozos de ADN que comprenden cada uno una secuencia particular de una estirpe de trigo modificado genéticamente.

9. Un método para determinar la tasa de mezclado de trigo modificado genéticamente en una muestra de ensayo, que comprende:

efectuar una PCR cuantitativa usando, como moldes, el ADN circular descrito en la reivindicación 7 u 8 y ADN extraído de la muestra de ensayo;

preparar una curva de calibración para determinar el número de moléculas de ADN molde, usando los resultados de la PCR cuantitativa para ADN circular;

determinar el número de moléculas que tienen una secuencia parcial de un ADN de trigo endógeno y el número de moléculas que tienen una secuencia parcial de una secuencia de ADN presente específicamente en al menos una clase de trigo modificado genéticamente contenida en la muestra de ensayo, usando la curva de calibración y los resultados de la PCR cuantitativa para la muestra de ensayo, y determinar la tasa de mezclado A obtenida dividiendo el número de moléculas que tienen una secuencia parcial de una secuencia de ADN presente específicamente en el trigo modificado genéticamente entre el número de moléculas que tienen una secuencia parcial de una secuencia de ADN de trigo endógeno.

10. El método según la reivindicación 9, que comprende adicionalmente

determinar la tasa de mezclado de trigo modificado genéticamente en una muestra calculando la fórmula 100 x A/B, usando la relación A y la relación B obtenida dividiendo el número de moléculas obtenido por PCR cuantitativa usando como molde ADN extraído de semillas patrón de trigo modificado genéticamente, que tienen una secuencia parcial de una secuencia de ADN presente específicamente en una estirpe particular de trigo modificado genéticamente, entre el número de moléculas que tienen una secuencia parcial de una secuencia de ADN de trigo endógeno.

11. Un método según la reivindicación 9 o 10, en el que se usa en dicha PCR cuantitativa al menos un par cebador seleccionado de los pares cebadores descritos en la reivindicación 4 o 5.

Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4 Fig. 5 Fig. 6 Fig. 7 Fig. 8