Método para detectar la presencia de una mutación puntual de una molécula de ácido nucleico diana en unantecedente de moléculas naturales de ácido nucleico,

que comprende las etapas de:

a. obtener una muestra de ácido nucleico;

b. poner en contacto dicha muestra de ácido nucleico, en condiciones de reacción apropiadas, con una solución quecomprende una mezcla de oligonucleótidos y una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena bajocondiciones de hibridación, en el que dicha mezcla de oligonucleótidos consiste en cebadores adecuados para unaamplificación isotérmica mediada por bucle de la región de la molécula de ácido nucleico incluyendo teóricamente lamutación puntual, comprendiendo dichos cebadores:

i) dos cebadores externos F3 y B3;

ii) dos cebadores internos FIP y BIP, en el que FIP incluye dos secuencias de oligonucleótidos F2 y F1c, y BIP incluyedos secuencias de oligonucleótidos, B2 y B1c, en el que dichos cebadores internos FIP y BIP pueden reconocer ehibridarse a dos regiones diferentes y opuestas, F2c y B2c respectivamente, de la molécula de ácido nucleico diana,en el que el cebador BIP está diseñado para hibridarse corriente abajo de la mutación puntual, o bien el cebador FIPestá diseñado para hibridarse corriente arriba de la mutación puntual, y en el caso de que el cebador BIP esté diseñadopara hibridarse corriente abajo de la mutación puntual, entonces el cebador FIP está diseñado para hibridarse a lasecuencia diana de modo que la mutación puntual se sitúe en o corriente abajo de la secuencia de F2c y corrientearriba de F1c, o en el caso de que el cebador FIP esté diseñado para hibridarse corriente arriba de la mutación puntual,entonces el cebador BIP está diseñado para hibridarse a la secuencia diana de modo que la mutación puntual se sitúeen o corriente arriba de la secuencia de B2c y corriente abajo de B1c;

iii) un cebador extensible autoalineado LB o LF respectivamente, que comprende:

- una secuencia de bucle central que puede reconocer selectivamente e hibridarse a la región que comprende lamutación puntual teórica de la molécula de ácido nucleico sólo si está presente la mutación puntual,

- una secuencia de extremo 5', y

- una secuencia de extremo 3', siendo dichas secuencias de extremo 5' y de extremo 3' complementarias entre sí paraformar un tallo, de modo que dicha secuencia de bucle central tenga una afinidad de hibridación mayor para la regiónque comprende la mutación puntual teórica de la molécula de ácido nucleico que la afinidad de hibridación de lasecuencia de extremo 5' con respecto a la secuencia de extremo 3', de modo que de como resultado un alineamientoy amplificación de la región que comprende la mutación puntual teórica de la molécula de ácido nucleico;

iv) un resto no extensible para reconocer e hibridarse selectivamente a la secuencia WT (natural) de la molécula deácido nucleico;

c. incubar la mezcla resultante a una temperatura constante;

d. detectar una señal indicativa de amplificación de la molécula de nucleótido que comprende la mutación puntual.

Método isotérmico rápido, altamente sensible, para la detección de mutaciones puntuales y SNP

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para detectar mutaciones puntuales de una secuencia de nucleótidos mediante una mejora del método de amplificación LAMP (polimerización mediada por amplificación por bucle) . Como realización no limitativa, la invención se refiere a la mutación G1849T del gen de JAK2.

Antecedentes

Los trastornos mieloproliferativos (TMP) son trastornos clonales de progenitores hematopoyéticos, e incluyen los TMP clásicos leucemia mielógena crónica (LMC) , policitemia verdadera (PV) , trombocitemia esencial (TE) y mielofibrosis 15 primaria (MFP) , así como leucemia eosinofílica crónica (LEC) , leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) y mastocitosis sistémica (MS) y otros. En las últimas dos décadas, se han identificado alelos mutantes en LMC, LMMC, LEC y MS2-5, y en cada caso, la mutación causante da como resultado la activación constitutiva de la señalización de tirosina cinasa. Las causas genéticas de los TMP más comunes seguían siendo desconocidas hasta la identificación de mutaciones que activan la señalización de la cinasa Janus 2 (JAK2) en la mayoría de los pacientes con PV, TE o MFP (1, 2, 3, 4) . La JAK2 es un miembro de la familia Janus de tirosina cinasas no receptoras citoplásmicas, que también incluye JAK1, JAK3 y TYK2. La mutación es una sustitución de guanina-a-timidina en la base 1489 (n.º de acceso al GenBank NM_004972) , que da como resultado una sustitución de valina por fenilalanina en el aminoácido 617 de la proteína JAK2 (JAK2V617F) , dentro del dominio pseudocinasa JH2 (5) . La pérdida de autoinhibición de JAK2 da como resultado la activación constitutiva de la cinasa, de manera análoga a otras mutaciones en TMP y leucemia

que activan de forma aberrante las tirosina cinasas (6, 7, 8) .

La secuenciación directa sólo es sensible hasta aproximadamente un 20% del ADN mutante en un antecedente natural (9, 10) . Este aspecto es muy relevante para los trastornos mielógenos crónicos, en los que la sangre y la médula a menudo se componen de una mezcla de elementos hematopoyéticos normales neoplásicos y residuales. En especial, en el caso de TE y SMD, en los que pueden estar presente mutaciones génicas fenotípicamente aparentes en pequeños clones comprendiendo menos de un 10% de la población de células de la médula total. James et al. (11) exploró este aspecto específicamente con respecto a 1849 G-T de JAK2 realizando una serie de experimentos de mezclado con células de eritroleucemia HEL, que llevan la mutación de JAK2, mezclada con células de eritroleucemia TF-1, que no lo llevan. Se falló en la detección del alelo mutado cuando estaba presente en < 5% del ADN total. Con

ADN de paciente con mutante homocigótico diluido en ADN de una persona sana, la secuenciación fue incluso menos sensible (10%) que con las líneas celulares (12) .

Un método común usado es el sistema de mutación refractario a la amplificación (ARMS) . Aprovecha el hecho de que los cebadores de oligonucleótidos deben estar perfectamente alineados en extremos 3' para que una ADN polimerasa extienda estos cebadores durante la PCR (12) . Al diseñar cebadores de oligonucleótidos que sólo se emparejen con una mutación puntual de ADN específica, tales como los que codifican V617F de JAK2, el ARMS puede distinguir entre alelos polimórficos. Por lo tanto, estas técnicas van por los nombres alternativos de "PCR específica de alelo" (AS-PCR) o "PCR de cebador específico de secuencia". La sensibilidad del ARMS es hasta de un 1 a un 2% (13) de ADN mutante en un antecedente natural.

45 La monitorización en tiempo real de la acumulación del producto de PCR durante el termociclado puede ser de utilidad como método semicuantitativo y se pueden usar ensayos de curvas de fusión de ADN junto con la PCR en tiempo real. Asimismo, James et al. (14) comparó la secuenciación de la química de tintes fluorescentes secuenciación con dos sistemas de detección de mutación basados en PCR en tiempo real diferentes, uno usando un instrumento LightCycler (Roche Diagnostics) y el otro usando una máquina Taqman ABI Prism 7500 (Applied Biosystems) . Estas técnicas de PCR en tiempo real detectaron de un 0, 5 a un 1% de ADN de línea celular de HEL diluido en ADN de línea celular de TF-1 y de un 2 a un 4% de ADN de paciente mutado homocigóticamente diluido en ADN de una persona sana.

Es posible un análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) ya que la mutación 1849 G-T

55 de JAK2 suprime un motivo en la secuencia de JAK2 natural que se reconoce por la enzima de restricción BsaXI. Aunque la supresión de un sitio de restricción no es tan satisfactoria como la creación de un nuevo sitio, debido a que una reacción de escisión enzimática negativa se podría deber a la ausencia de la mutación o bien al fallo en el procedimiento de digestión, puede ser útil como un análisis de primer paso. La sensibilidad proporcional comunicada depende en parte del método usado para detectar los fragmentos y aproximadamente es de un 20% de ADN mutante en un antecedente natural (15, 16) .

La pirosecuenciación es un método de genotipado rápido que depende de la liberación de pirofosfato (PPi) siempre que se incorpore un dNTP en una cadena de ADN creciente durante la polimerización de ADN conducida por plantilla (17) . La pirosecuenciación de JAK2 usando el sistema HS 96 PSQ automatizado (Biotage, Uppsala, Suecia) se ha

65 tratado por varios grupos (17, 18) con experimentos de dilución similares a los descritos anteriormente mostrando una sensibilidad del ensayo comunicado de un 5 a un 10% de alelos mutantes en un antecedente natural.

Se han descrito muchas otras técnicas de detección de mutación, incluyendo el análisis de polimorfismo de conformación de cadena simple (PCCS) , electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE) , cromatografía líquida de alta eficacia de desnaturalización (DHPLC) , ensayos de extensión de cebador de nucleótido

simple (Pronto) , y otros. De hecho, la DHPLC puede detectar la mutación de ADN genómico subyacente a V617F de JAK2 de forma fiable, y puede detectar mutaciones en una proporcionalidad de <1 a un 2%. Sin embargo, la DHPLC y las otras técnicas son un reto técnico o bien son laboriosas o ambas cosas. Éstas no permiten un alto rendimiento a un coste adecuado para un laboratorio clínico (PCCS y DGGE) o bien requieren una inversión inicial considerable en equipo (DHPLC) .

En teoría, también se podían usar técnicas basadas en proteínas para detectar la mutación V617F de JAK2, pero en general son engorrosas, y el acceso a estos recursos es limitado. Por lo tanto, normalmente no se prefieren ensayos basados en proteínas si las pruebas basadas en ADN o ARN son viables.

El documento EP 1692281 da a conocer un método de detección de mutación de JAK2 basado en la amplificación de PCR. El método descrito presenta varias limitaciones. La primera de todas, el menor nivel de sensibilidad, que permite la detección de las secuencias mutantes de JAK2 de hasta un 1% de la muestra en el mejor de los casos. Esta sensibilidad requiere el enriquecimiento de los mutantes por medio de aislamiento de granulocitos antes de la extracción. Esta etapa consume tiempo y es laboriosa y añade aproximadamente 2 horas a los procedimientos ya largos (desde 2 hasta 5 horas) requeridos para el diagnóstico. Además, todos los métodos descritos son relativamente laboriosos y caros, requiriendo a menudo un equipo especializado que no siempre puede estar fácilmente disponible.

Los métodos para la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) empleando cebadores internos FIP y BIP y cebadores de bucle LB o LF, además de cebadores externos F3 y B3, se dan a conocer en la solicitud internacional de

patente WO 2009/049630; la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. n.º US 2007/218464; la solicitud de patente europea EP 1975249; así como en la referencia NAGAMINE et al., Clinical Chemistr y , vol. 47, n.º 9, septiembre de 2001, páginas 1742-1743.

Descripción de la invención

Los autores de la presente invención han establecido un método novedoso para la detección de mutaciones puntuales que es selectivo y rápido. El método se aparta de la tecnología LAMP, como se da a conocer en el documento EP 1020534... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar la presencia de una mutación puntual de una molécula de ácido nucleico diana en un

antecedente de moléculas naturales de ácido nucleico, que comprende las etapas de: 5

a. obtener una muestra de ácido nucleico;

b. poner en contacto dicha muestra de ácido nucleico, en condiciones de reacción apropiadas, con una solución que comprende una mezcla de oligonucleótidos y una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena bajo condiciones de hibridación, en el que dicha mezcla de oligonucleótidos consiste en cebadores adecuados para una amplificación isotérmica mediada por bucle de la región de la molécula de ácido nucleico incluyendo teóricamente la mutación puntual, comprendiendo dichos cebadores:

i) dos cebadores externos F3 y B3;

ii) dos cebadores internos FIP y BIP, en el que FIP incluye dos secuencias de oligonucleótidos F2 y F1c, y BIP incluye dos secuencias de oligonucleótidos, B2 y B1c, en el que dichos cebadores internos FIP y BIP pueden reconocer e hibridarse a dos regiones diferentes y opuestas, F2c y B2c respectivamente, de la molécula de ácido nucleico diana, en el que el cebador BIP está diseñado para hibridarse corriente abajo de la mutación puntual, o bien el cebador FIP está diseñado para hibridarse corriente arriba de la mutación puntual, y en el caso de que el cebador BIP esté diseñado para hibridarse corriente abajo de la mutación puntual, entonces el cebador FIP está diseñado para hibridarse a la secuencia diana de modo que la mutación puntual se sitúe en o corriente abajo de la secuencia de F2c y corriente arriba de F1c, o en el caso de que el cebador FIP esté diseñado para hibridarse corriente arriba de la mutación puntual, entonces el cebador BIP está diseñado para hibridarse a la secuencia diana de modo que la mutación puntual se sitúe

en o corriente arriba de la secuencia de B2c y corriente abajo de B1c;

iii) un cebador extensible autoalineado LB o LF respectivamente, que comprende:

- una secuencia de bucle central que puede reconocer selectivamente e hibridarse a la región que comprende la mutación puntual teórica de la molécula de ácido nucleico sólo si está presente la mutación puntual,

- una secuencia de extremo 5', y

- una secuencia de extremo 3', siendo dichas secuencias de extremo 5' y de extremo 3' complementarias entre sí para

formar un tallo, de modo que dicha secuencia de bucle central tenga una afinidad de hibridación mayor para la región que comprende la mutación puntual teórica de la molécula de ácido nucleico que la afinidad de hibridación de la secuencia de extremo 5' con respecto a la secuencia de extremo 3', de modo que de como resultado un alineamiento y amplificación de la región que comprende la mutación puntual teórica de la molécula de ácido nucleico;

iv) un resto no extensible para reconocer e hibridarse selectivamente a la secuencia WT (natural) de la molécula de ácido nucleico;

c. incubar la mezcla resultante a una temperatura constante;

45 d. detectar una señal indicativa de amplificación de la molécula de nucleótido que comprende la mutación puntual.

2. El método de la reivindicación 1 en el que la mutación puntual está situada en la región entre F2 y F1c o B2 y B1c.

3. El método de la reivindicación 1 en el que la mutación puntual está situada en la región detectada por B2 o F2.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia en el extremo 5' y la secuencia en el extremo 3' de dicho cebador extensible autoalineado es de al menos 3 nucleótidos.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el resto no extensible es un ácido nucleico 55 peptídico (ANP) .

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho ácido nucleico peptídico (ANP) tiene al menos 10 nucleótidos.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho ácido nucleico peptídico (ANP) comprende una secuencia de bases que se pueden hibridar con la región que incluye la mutación puntual teórica dando como resultado estructuras bicatenarias que tienen respectivamente una temperatura de fusión (Tm) = X con la secuencia natural y una temperatura de fusión (Tm) = Y con la secuencia mutante, donde Y < temperatura de incubación : X y X es al menos 5ºC mayor que Y.

8. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el que el resto no extensible es un cebador no extensible autoalineable, que comprende una secuencia de bucle central que puede reconocer selectivamente e hibridarse a la región que comprende la secuencia natural de la molécula de ácido nucleico, una secuencia de extremo 5' y una secuencia de extremo 3', siendo dichas secuencias de extremo 5' y de extremo 3' complementarias entre sí para formar un tallo, de modo que dicha secuencia de bucle central tenga una afinidad de hibridación mayor para la región

que comprende la secuencia natural de la molécula de ácido nucleico que la afinidad de hibridación de la secuencia de extremo 5' con respecto a la secuencia de extremo 3', de modo que de como resultado un alineamiento y bloqueo de la secuencia wt;

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha ADN polimerasa con 10 actividad de desplazamiento de cadena es la polimerasa de fragmento grande Bst.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 8, en el que dicha ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena es una o una combinación de: fragmento Bca (exo-) , Vent, Vent (exo-) , Deep Vent, Deep Vent (exo-) , fago c29, fago MS-2, Z-Taq, KOD, Klenow.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la temperatura constante está comprendida entre 62 y 67 ºC.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la señal indicativa de 20 amplificación de la molécula de nucleótido que comprende la mutación puntual se detecta por turbidimetría.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 11, en el que la señal indicativa de amplificación de la molécula de nucleótido que comprende la mutación puntual se detecta por fluorescencia.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula de ácido nucleico comprende la región del gen JAK2 humano (n.º de acceso al GenBank NM_004972 ilustrado en la figura 11a, b, c) , que tiene teóricamente la mutación puntual, sustitución de guanina-a-timidina en la base 1849 (G1849T) .

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que F2 y F1c están en la posición 1730-1750 y 1770-1795

respectivamente de la secuencia génica NM_004972; B2 está en la posición 1862-1884 de la secuencia génica NM_004972 y B1c está en la posición 1810-1840 de la secuencia génica NM_004972 ilustrada en la figura 11a, b, c.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que los cebadores tienen las siguientes secuencias:

35 F.

5. GCATCTTTATTATGGCAGAGAG- 3' (Seq Id No. 1) ; B.

5. TGCTCTGAGAAAGGCATTA- 3' (Seq Id No. 2) ;

FI.

5. GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC-3' (Seq Id No. 3) ;

BIP S'-GCTTTCTCACMGCATTTGGTTTTAMTTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC-S' (Seq Id No. 4) . 40

17. El método de acuerdo con las reivindicaciones 15 ó 16, en el que dicho resto no extensible es una molécula de ANP.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicha molécula de ANP tiene la estructura: 45 NH2GAGTATGTGTCTGTGGACONH2.