Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades que cursan con necrosis isquémica intestinal,

y para evaluar la respuesta al tratamiento.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico en un estadio temprano de enfermedades que cursan con necrosis isquémica intestinal en humanos, y en particular de la enterocolitis necrotizante, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dichas enfermedades, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali- y cuantitativo) específico, que es diferente dependiendo del estado de la enfermedad y se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz. Kit que comprende los medios necesarios para llevar a cabo el método de la invención.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades que cursan con necrosis isquémica intestinal, y para evaluar la respuesta al tratamiento.

La presente invención se encuentra dentro de la medicina, la enzimología y la biología molecular, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades que cursan con necrosis isquémica intestinal en humanos, y en particular de la enterocolitis necrotizante en un estadio temprano, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dichas enfermedades, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali- y cuantitativo) específico, que es diferente dependiendo del estado de la enfermedad y se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La necrosis isquémica intestinal, aparece cuando el flujo sanguíneo del territorio mesentérico resulta insuficiente para satisfacer las necesidades requeridas por el intestino. A diferencia de las formas crónicas, en las que el desarrollo progresivo de colaterales impide la necrosis intestinal, en las formas de instauración aguda, la viabilidad del intestino puede quedar comprometida, abocando a una situación de riesgo vital. El suministro de oxígeno a las células depende de una compleja interacción de factores: flujo de sangre que circula por los vasos principales, concentración de hemoglobina y su saturación de oxígeno, distribución de sangre en la pared intestinal, intercambio de oxígeno entre la capa más basal de la mucosa y la porción más distal, balance entre las demandas metabólicas y el aporte real de oxígeno y nutrientes en la mucosa, capacidad de las propias células para utilizar el oxígeno…etc, pero independientemente del mecanismo que desencadene la isquemia, la secuencia de hechos posterior es muy parecida.

El infarto intestinal en la anatomía patológica microscópica conlleva: edema, congestión, hemorragia y necrosis con desprendimiento de la mucosa. Se puede presentar como infarto hemorrágico, úlceras aisladas o serpiginosas, placas mucosas con pseudomembranas...etc. Puede afectarse cualquier segmento intestinal. Los cambios isquémicos pueden ser parcheados o difusos, y consisten en hemorragia de la lámina propia asociada a necrosis de la mucosa. Dependiendo de la duración de la hipoxia, los cambios pueden ser reversibles o llegar a infarto de todo el grosor de la pared. En las piezas de resección se pueden encontrar lesiones vasculares como trombosis o inflamación.

Atendiendo a su origen, las enfermedades que pueden cursar con isquemia intestinal principalmente se pueden clasificar en:

A) . de origen vascular

- Colitis isquémica (70-75%) : Arterioesclerosis, Oclusión vascular (Embolia o trombosis mesentérica arterial, trombosis venosa, traumatismos) , obstrucción del colon (impactación fecal, neoplasias) , shock o estados de bajo gasto asociados a hipotensión (arritmias, insuficiencia cardíaca, diálisis, sepsis, deshidratación) , tratamiento con medicamentos (digital, calcioantagonistas, sumatriptán, metisergida, vasopresina, agonistas alfa-adrenérgicos, antagonistas ß-adrenérgicos, diuréticos, triptanes, AINE, ergotamina, danazol, sales de oro, neurolépticos, Interferón, fármacos psicótropos) , enfermedades hematológicas (déficit de proteína C, déficit de proteína S, déficit de antitrombina III, anemia de células falciformes) , enfermedad de pequeños vasos (diabetes mellitus, vasculitis, amiloidosis, artritis reumatoide, lesiones por radiación) , cirugía de aorta abdominal, abuso de cocaína, corredores de larga distancia, Síndrome del intestino irritable e Idiopática (siendo la enterocolitis necrotizante la primera causa en la infancia) .

- Isquemia mesentérica aguda (25-30%) : Embolia de la arteria mesentérica superior 50%, trombosis de la arteria mesentérica superior 10%, isquemia mesentérica no oclusiva 25%, trombosis venosa mesentérica 10%. Primaria (30%) : deficiencia de antitrombina III, deficiencia de proteína C, deficiencia de proteína S, policitemia vera, trombocitosis, neoplasias, anticonceptivos orales, embarazo, esplenectomía, anemia de células falciformes, síndrome mieloproliferativo. Secundaria (60%) : Procesos sépticos intraabdominales: apendicitis, diverticulitis, colangitis, perforación gastrointestinal, abscesos...etc, pancreatitis aguda y crónica, enfermedad inflamatoria intestinal, hipertensión portal, gastroenteritis aguda, neoplasia, traumatismo abdominal) , Isquemia focal segmentaria 5% (por embolias de colesterol, vasculitis, traumatismos o lesiones por radiación)

- Isquemia mesentérica crónica 5%.

B) . Otras causas no propiamente vasculares, son secundarias a enfermedades obstructivos intestinales tipo mecánicos: vólvulo, intususpección, hernias, bridas …etc.

La enterocolitis necrotizante (ECN) es la enfermedad gastrointestinal aguda y urgente más frecuente en neonatos. Su incidencia se estima 2, 5 de cada 1000 recién nacidos vivos y 1-5% de los ingresos en las unidades neonatales, alcanzando el 12% en los menores de 1500 g al nacimiento. Tiene alta tasa de morbimortalidad, con gran repercusión en los costes de las unidades neonatales. Su patogenia es multifactorial y su fisiopatología aún no está clara.

ES 2 385 583 Al El diagnóstico del sufrimiento intestinal se basa en la combinación de hallazgos clínicos y radiológicos, a menudo ambiguos y tardíos frente a los cambios anatomopatológicos. Por ello, los esfuerzos actuales se dirigen a la prevención de los factores de riesgo, al reconocimiento temprano de los signos-síntomas y al desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas, para minimizar los riesgos de la enfermedad y sus complicaciones. La variabilidad en la forma de presentación del cuadro clínico y la patocronia de la enfermedad dificultan, en ocasiones, el diagnóstico diferencial. El tratamiento inicial suele ser esencialmente médico y, en ocasiones, incluye la colocación de un catéter de drenaje peritoneal para la descompresión y el lavado de los mediadores inflamatorios exudados al peritoneo. En un 40% de los casos es necesaria la intervención quirúrgica que conlleva secuelas importantes a medio y largo plazo, y un aumento de las estancias medias de las unidades neonatales.

En 1978, Bell y cols. (Ann Surg 187 (1) :1-7) elaboraron un sistema clínico de estadiaje útil para comparar casos, más que para orientar el tratamiento:

• Etapa I: sospecha.

• Etapa II: enfermedad definida (signos radiológicos positivos)

• Etapa III: enfermedad avanzada: shock séptico y neumoperitoneo.

Posteriormente, Walsh y Kliegman (1986. Pediatr Clin North Am 33: 179-20) modificaron estos criterios en un intento de realizar una clasificación que sirviera mejor de guía para el diagnóstico, pronostico y tratamiento de los pacientes: “Clasificación de Bell modificada”:

Estadio 1A: Signos sistémicos, como temperatura inestable, apnea, bradicardia y letargia; signos intestinales, como aumento del residuo gástrico, distensión abdominal leve y presencia de sangre en heces. Signos radiológicos, como distensión o íleo leve, aunque la radiología puede ser normal.

Estadio 1B: además de lo anterior, aparición de deposiciones sanguinolentas por el recto.

Estadio 2A: similares a lo anterior y además ausencia de ruidos intestinales o distensión abdominal; en la radiografía se observa dilatación intestinal, íleo y neumatosis.

Estadio 2B: a los mismos signos ya descritos, se agrega acidosis y trombocitopenia leves; en los signos intestinales se agrega ausencia de ruidos, tensión abdominal franca, celulitis abdominal o masa en cuadrante inferior derecho; al estudio radiográfico se agrega gas en la vena porta, con o sin ascitis.

Estadio 3A: se pueden ver los mismos efectos sistémicos que en el IIB, pero se añade hipotensión arterial, bradicardia, apnea grave, acidosis mixta, coagulación intravascular diseminada y neutropenia; en los signos intestinales, se agrega peritonitis generalizada, tensión abdominal moderada y distensión del abdomen; en los signos radiológicos se observa ascitis franca.

Estadio 3B: los signos sistémicos y gastrointestinales son los mismos que en el estadio anterior, pero en la radiografía se aprecia neumoperitoneo.

Las pruebas complementarias específicas para el diagnóstico de la enterocolitis necrotizante son escasas, e incluso infructuosas en lesiones iniciales. Tonometría... [Seguir leyendo]

1. El uso de la enzima beta-glucosidasa citosólica humana, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico, o seguimiento de las enfermedades que cursan con necrosis isquémica intestinal en humanos.

2. El uso de la enzima beta-glucosidasa citosólica humana según la reivindicación anterior, donde la enfermedad que cursa con necrosis isquémica intestinal se selecciona de la lista que comprende: colitis isquémica, isquemia mesentérica aguda, isquemia mesentérica crónica y enterocolitis necrotizante.

3. El uso de la enzima beta-glucosidasa citosólica humana según la reivindicación anterior, donde la enfermedad que cursa con necrosis isquémica intestinal es la enterocolitis necrotizante. 4-Un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de enfermedades que cursan con necrosis isquémica intestinal en humanos, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) determinar la actividad de la enzima beta-glucosidasa citosólica humana en la muestra biológica aislada de (a) . 5-El método según la reivindicación anterior, que además comprende: c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.

6. Un método de diagnóstico, pronóstico y seguimiento de enfermedades que cursan con necrosis isquémica intestinal en humanos, que comprende los pasos (a) – (c) según las reivindicaciones 4-5, donde el aumento significativo por encima de la cantidad de referencia de la actividad de la enzima beta-glucosidasa citosólica humana es diagnóstica de dicha enfermedad.

7. Un método de seguimiento de la evolución de enfermedades que cursan con necrosis isquémica intestinal en humanos, que comprende:

a) tomar una muestra biológica aislada de un individuo, b) detectar la actividad de la enzima beta-glucosidasa citosólica humana, en la muestra biológica aislada de (a) .

c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia, y d) repetir al menos dos veces la secuencia de pasos (a) – (c) en muestras obtenidas del mismo individuo del paso (a) , de manera no simultánea. 8-El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde la enfermedad que cursa con necrosis isquémica intestinal se selecciona de la lista que comprende: colitis isquémica, isquemia mesentérica aguda, isquemia mesentérica crónica y enterocolitis necrotizante. 9-El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-8, donde la enfermedad que cursa con necrosis isquémica intestinal es la enterocolitis necrotizante.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, donde el individuo del paso (a) es un neonato.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, donde el individuo del paso (a) es un lactante.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-11, donde la cantidad de referencia es 14

miliunidades de actividad enzimática beta-glucosidasa citosólica humana.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-12, donde la cantidad de referencia es 15 miliunidades de actividad enzimática beta-glucosidasa citosólica humana.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-13, donde la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es el suero.

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-14, donde la muestra biológica aislada se obtiene del cordón umbilical.

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-15, donde la muestra biológica aislada se obtiene del talón.

17. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-16, donde la actividad de la beta-glucosidasa citosólica se determina mediante análisis fluorométrico.

ES 2 385 583 Al 18-Un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para analizar la actividad de la betaglucosidasa citosólica humana.

19. Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende 4 metil-umbeliferil-beta-dglucopiranósido.

20. El uso del kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 18-19, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de enfermedades que cursan con necrosis isquémica intestinal en humanos.

21. El uso del kit o dispositivo según la reivindicación anterior, donde la enfermedad que cursa con necrosis isquémica intestinal es la enterocolitis necrotizante.

ES 2 385 583 Al Fig. 1

ES 2 385 583 Al Fig. 2

ES 2 385 583 Al LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Servicio Andaluz de Salud

<120> Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades que cursan con necrosis isquémica intestinal, y para evaluar la respuesta al tratamiento.

<130> P-04146

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 469

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Phe Pro Ala Gly Phe Gly Trp Ala Ala Ala Thr Ala Ala Tyr 1 5 10 15 Gln Val Glu Gly Gly Trp Asp Ala Asp Gly Lys Gly Pro Cys Val Trp

Asp Thr Phe Thr His Gln Gly Gly Glu Arg Val Phe Lys Asn Gln Thr 35 40 45 Gly Asp Val Ala Cys Gly Ser Tyr Thr Leu Trp Glu Glu Asp Leu Lys 50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95 Ile Asp Tyr Tyr Asn Lys Ile Ile Asp Asp Leu Leu Lys Asn Gly Val 100 105 110 Thr Pro Ile Val Thr Leu Tyr His Phe Asp Leu Pro Gln Thr Leu Glu 115 120 125 Asp Gln Gly Gly Trp Leu Ser Glu Ala Ile Ile Glu Ser Phe Asp Lys 130 135 140

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ES 2 385 583 Al Ala Ala His Asn Leu Ile Lys Ala His Ala Arg Ser Trp His Ser Tyr 195 200 205

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Glu Ala Ala Lys Arg Ala Ile Thr Phe His Leu Asp Leu Phe Ala Lys 245 250 255 Pro Ile Phe Ile Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Val Val Lys Ser Gln Ile 260 265 270 Ala Ser Met Ser Gln Lys Gln Gly Tyr Pro Ser Ser Arg Leu Pro Glu 275 280 285 Phe Thr Glu Glu Glu Lys Lys Met Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe 290 295 300

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ES 2 385 583 Al <211> 162

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<213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Phe Pro Ala Gly Phe Gly Trp Ala Ala Ala Thr Ala Ala Tyr 1 5 10 15 Gln Val Glu Gly Gly Trp Asp Ala Asp Gly Lys Gly Pro Cys Val Trp

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