MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN DE LOS PATÓGENOS DE PECES: PHOTOBACTERIUM DAMSELA, TENACIBACULUM SOLEAE, TENACIBACULUM MARITIMUM Y VIBRIO HARVEYI.

Método de identificación de los patógenos de peces: Photobacterium damselae,

Tenacibaculum soleae, Tenacibaculum maritimum y Vibrio harveyi mediante PCR y RLB (Reverse-line blot hybridization), sondas y kit de detección.

Método de identificación de los patógenos de peces: Photobacterium damselae, Tenacibaculum soleae, Tenacibaculum maritimum y Vibrio harveyi.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la veterinaria y se refiere a la detección e identificación de las especies bacterianas, Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum soleae y Vibrio harveyi, todas ellas agentes etiológicos de enfermedades comunes en peces cultivados, y por tanto, de especial importancia en el campo de la acuicultura.

Estado de la técnica anterior

La acuicultura ha sido uno de los sectores de la producción animal que más rápidamente ha crecido en los últimos veinte años debido, fundamentalmente, a los avances tecnológicos. Sin embargo, el estrés causado por distintos factores ambientales, como variaciones en la temperatura o altas densidades de cultivo, hace que disminuyan los mecanismos de defensa de los peces. Estos factores, unidos a otros como, por ejemplo, la presencia en el medio de contaminación orgánica que favorece el aumento de patógenos oportunistas, pueden llevar a la aparición de brotes patológicos. Así pues, en los sistemas de cultivos intensivos y semi-intensivos, las enfermedades de origen infeccioso (virus, bacterias, hongos, etc.) son un factor limitante que puede determinar la calidad y seguridad del producto final. Un diagnóstico rápido y preciso de las enfermedades, la aplicación de medidas preventivas y unos estudios epidemiológicos precisos constituyen las claves para minimizar el impacto de las enfermedades en la acuicultura. Por eso, es necesario revisar los métodos actuales de diagnóstico para mejorar el manejo sanitario de las explotaciones acuícolas, y el control de las enfermedades.

Dentro de las patologías infecciosas, son las de origen bacteriano las más frecuentes y a menudo también las mas problemáticas y difíciles de controlar. En concreto son muy frecuentes cuatro especies de bacterias gram negativas patógenas de peces, que pueden aparecer aisladas o conjuntamente en un episodio de mortalidad: Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum soleae y Vibrio harveyi.

Photobacterium damselae comprende dos subespecies fenotípicamente distintas y que desarrollan distintas enfermedades, aunque ambas han sido asociadas con enfermedades en animales marinos. P. damselae subsp. piscicida (antes Pasteurella piscicida) es el agente etiológico de la pasteurelosis, una enfermedad caracterizada por la ausencia de lesiones externas y la presencia de hemorragias y granulomas en hígado, riñón y bazo. Es una de las enfermedades más devastadoras en acuicultura marina, causando mortalidades masivas en muchas especies de peces con una distribución mundial (Zorrilla et al., 1999, Journal of fish diseases 22:167-172; Romalde et al., 2002. Systematic and Applied Microbiology 25: 544-550, Toranzo et al., 2005. Aquaculture 246: 37-61) . Por otro lado, la subespecie P. damselae subsp. damselae (antes Vibrio damsela) comprende cepas que producen úlceras cutáneas y septicemia hemorrágica en un amplio rango de peces. Aunque generalmente es descrito como un patógeno secundario, algunos aislados pueden ser patógenos primarios en peces e incluso en humanos (Fouz et al., 2000. Journal of Applied Microbiology 88:531-535, Fouz et al., 1992. FHS/AFS Newsletter 20:3-4, Shin et al., 1996. Clinical Infectious Diseases 22:856-857) . La identificación de esta especie se puede realizar mediante cultivo y caracterización bioquímica (API 20E, API CH50) , mediante técnicas inmunológicas (aglutinación, ELISA) , o mediante métodos moleculares basados en la PCR, más sensibles y rápidos. En este sentido, Kvitt et al., 2002. (Diseases of Aquatic Organisms 48:187-195) y Osorio et al., 1999 (Applied and Environmental Microbiology 65 (7) : 2942-2946) desarrollaron protocolos de PCR con cebadores específicos para

P. damselae, diseñados en el gen de ADN ribosómico 16S, mientras que Rajan et al., 2003 (Journal of Applied Microbiology 95:1375-1380) lo hizo basándose en la secuencia del gen del polisacárido capsular. González et al., 2004 (Journal of Clinical Microbiology. p1414-1419) diseñaron sondas basándose en los loci ureC (ureasa) y dly (síntesis de damselina) para la identificación de P. damselae subsp. damselae utilizando microarrays de ADN. Para la diferenciación de las dos subespecies, Osorio et al., 2000 propusieron una PCR múltiple con primers dirigidos a los genes 16S y ureC. La diferenciación de las dos subespecies se hace en base a la ausencia o presencia del gen de la ureasa (ureC) .

Tenacibaculum maritimum es el agente etiológico de la tenacibaculosis o flexibacteriosis, enfermedad ulcerativa de distribución mundial que afecta a gran número de especies de peces marinos y que tiene un considerable impacto económico en la acuicultura marina. La enfermedad fue descrita en 1977 por Masumura y Wakabayashi en Japón causando altas mortalidades en peces marinos cultivados. Se caracteriza por la aparición de cuadros ulcerativos en la superficie corporal del pez, erosión en aletas y boca, pudiendo llegar a causar en algunos casos cuadros septicémicos. El aislamiento de la bacteria a partir de las lesiones puede resultar complicada, pues es fácilmente ocultada o inhibida por el crecimiento de otras bacterias presentes en las mismas (Avendaño-Herrera et al., 2006. Diseases of Aquatic Organisms. 71: 255-266) . La identificación del patógeno se puede realizar en base a características morfológicas y bioquímicas, o mediante métodos moleculares. Toyama et al. 1996 (Fish Pathology, 31 (1) : 25-31) y Bader y Shotts 1998 (Journal of Aquatic Animal Health, 10 (4) : 311-319) diseñaron cebadores específicos que usaban como diana el gen del ARN ribosómico 16S, flanqueando fragmentos de 1088 pb y 400 pb. Otros autores desarrollaron métodos basados en la PCR, como PCR-ELISA (Wilson et al., 2002. Journal of Microbiological Methods 51 (33) : 163-170) , RT-PCR-EHA (Wilson y Carson, 2003. Diseases of Aquatic Organisms 54:127-134) y microarrays con sondas de ADN (Warsen et al., 2004. Applied and Environmental Microbiology 70: 4216-4221) .

Tenacibaculum soleae es un patógeno bacteriano recientemente descrito, aislado hasta el momento en ejemplares enfermos de lenguado senegalés (Solea senegalensis) en Galicia, España (Piñeiro-Vidal et al., 2008. International Journal of Systematic and Evolutionar y Microbiology, 58 (4) :881-885) . La identificación de esta especie se puede realizar en base a características morfológicas, bioquímicas y serológicas. No existe en la actualidad ningún método de diagnostico rápido, basado en la PCR, específico para esta especie.

Vibrio harveyi (sinónimos: Vibrio carchariae, Vibrio trachuri) es un importante patógeno bacteriano, causante de vibriosis en un amplio número de vertebrados e invertebrados marinos. Particularmente afecta a los cultivos de estos últimos (langostinos peneidos, langostas, orejas de mar, etc.) en Asia y Sudamérica, causando mortalidades masivas que resultan en graves pérdidas económicas y constituyendo un importante factor limitante en el desarrollo de los mismos. Sin embargo también ha sido descrito causando grandes mortalidades en distintas especies de peces cultivados (lenguado, mero, besugo, etc.) . Ha sido aislado también en ejemplares enfermos de distintas especies de tiburones, y causando gastroenteritis en humanos. Los síntomas que presentan los peces afectados van desde úlceras cutáneas hasta lesiones en los ojos, gastroenteritis, etc. (Austin y Zhang, 2006. Letters in Applied Microbiology 43:119-124) . La identificación del patógeno mediante tests bioquímicos convencionales es problemática debido a la heterogeneidad fenotípica -y genotípica-de V. harveyi y a su estrecha relación con otras especies de vibrios como V. parahaemolyticus,

V. alginolyticus y V. campbellii. Gomez-Gil et al., 2004 (Microbiology 150:1769-1777) mostraron que V. harveyi y V. campbellii eran indistinguibles en mas de 100 características fenotípicas. Se han desarrollado varios métodos de identificación basados en la PCR. Así, Oakey et al., 2003 (Journal of Applied Microbiology. 95:1293-1303) y Hernández y Olmos 2004 (Applied Microbiology and Biotechnology 63:722-727) desarrollaron protocolos de PCR con cebadores específicos para V. harvey diseñados en el gen del ARN ribosómico 16S y en el gen lux N, respectivamente. Conejero y Hedreyda, 2003 (Journal of Applied Microbiology 95:1293-1303) y Pang et al., 2006 (Letters in Applied Microbiology 43 (3) :249-255) hicieron lo propio utilizando como diana el gen toxR. No obstante, Oackey et al., 2003.... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección de bacterias, que comprende:

a. extraer el ADN total de una muestra biológica aislada,

b. poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción, que contiene los cebadores para la amplificación de la región ribosomal intergénic.

16. 23S y parte de ambos genes ribosómicos flanqueantes.

c. amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa, la región ribosomal intergénic.

16. 23S y parte de ambos genes ribosómicos flanqueantes,

d. identificar la presencia o ausencia de al menos una de las especies Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum soleae mediante RBL con al menos una de las sondas cuya secuencia consiste en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente.

2. Método para la detección de bacterias, que comprende los pasos (a) - (c) según la reivindicación anterior, y además:

d. identificar la presencia o ausencia simultánea de Vibrio harveyi y al menos una de las especies Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum y Tenacibaculum soleae mediante RBL con la sonda cuya secuencia se recoge en SEQ ID NO:6yal menos una de las sondas cuya secuencia se recoge en la SEQ ID NO:3, SEQ IDNO: 4y SEQ IDNO: 5.

3. Método para la detección de bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde los cebadores para la amplificación de la región intergénic.

16. 23S según el paso (b) son universales.

4. Método para la detección de bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde los cebadores para la amplificación de la región intergénic.

16. 23S según el paso (b) son las secuencias nucleotídicas que consisten en la SEQ ID NO:1ylaSEQ ID NO: 2.

5. Método para la detección de bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la identificación de las especies bacterianas Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum soleae y Vibrio harveyi se realiza a partir de cultivos puros.

6. Método para la detección de bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la muestra del paso

(a) es una muestra biológica aislada de un organismo de interés.

7. Método para la detección de bacterias según la reivindicación 6, donde el organismo de interés del que se obtiene la muestra biológica es un pez.

8. Método para la detección de bacterias según la reivindicación 6, donde el organismo de interés del que se obtiene la muestra biológica es un artrópodo.

9. Método para la detección de bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que además comprende, al menos, un control de amplificación interno.

10. Sondas cuya secuencia nucleotídica consiste en las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, que son específicas para la detección de las especies bacterianas Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum y Tenacibaculum soleae, respectivamente.

11. Sonda cuya secuencia nucleotídica consiste en las SEQ ID NO: 6, para la detección de la especie bacteriana Vibrio harveyi.

12. Kit de detección de bacterias que comprende las sondas según la reivindicación 10.

13. Kit de detección de bacterias según la reivindicación anterior, que además comprende la sonda cuya secuencia nucleotídica consiste en las SEQ ID NO: 6.

14. Kit de detección de bacterias que comprende los medios adecuados para llevar a cabo el método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Instituto Andaluz de investigación y Formación Agraria, Pesquera, Alimentaria y de la Producción Ecológica

<120> Método de identificación de los patógenos de peces: Photobacterium damselae, Tenacibaculum soleae, Tenacibaculum maritimum y Vibrio harveyi.

<130> 1682.6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 16/23SF

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 16/23SR

<400> 2

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sonda PG321

<400> 3

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sonda PG443

<400> 4

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sonda PG47

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sonda PG91

<400> 6