MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN DEL TROPISMO DEL VIRUS VIH.
Método de identificación del tropismo del virus VIH.
La presente invención se refiere a un método de identificación del tropismo del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en pacientes infectados con dicho virus.
El método comprende el cocultivo de células aisladas mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de un paciente infectado con el VIH y PBMCs de un sujeto control sano, donde se deplecionan las células PBMCs CD8 positivas del paciente infectado con VIH y/o del sujeto control sano. Los viriones liberados al medio de cultivo son inoculados mediante espinoculación a una línea celular humana aislada del cuerpo humano, CD4 positiva que expresan el correceptor CCR5 (CD4+/CCR5+/CXCR4-) ya una línea celular humana aislada del cuerpo humano, CD4 positiva que expresa el correceptor CXCR4 (CD4+/CCR5-/CXCR4+). Dicho método permite determinar el tropismo viral mediante la cuantificación de la proporción de cuasiespecies víricas que utilizan uno u otro correceptor.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200931309.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: LEAL NOVAL,MANUEL, RUIZ-MATEOS CARMONA,EZEQUIEL, GONZALEZ-SERNA MARTIN,MANUEL ALEJANDR.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Fragmento de la descripción:
Método de identificación del tropismo del virus VIH.
Campo de la invención
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina y concretamente se refiere a un método de identificación del tropismo del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en pacientes infectados con dicho virus.
Estado de la técnica anterior
El VIH entra en las células que expresan el receptor CD4 y los receptores de quimioquinas CCR5 y/o CXCR4. Según el virus utilice para entrar el correceptor CCR5, CXCR4 o ambos se definirá el tropismo vírico como R5, X4 o dual, respectivamente.
En la década de los noventa se produjeron una serie de observaciones sobre los mecanismos del VIH de gran relevancia, que sentaron las bases para la investigación de moléculas capaces de ejercer un efecto antagónico sobre los receptores de quimioquinas: 1) La capacidad de algunos aislados víricos de pacientes para inducir la formación de sincitios cuando se cultivan en células MT2, y su valor pronóstico a lo largo de la historia natural de la infección (Koot et al., 1993. Ann Int Med., 118: 681-688). 2) El requerimiento de un cofactor, en conjunción con la molécula CD4, para la entrada del VIH en la célula (Harrington et al., 1993. J Virol., 67: 5939-6947). 3) La propiedad de CC-quimioquinas para inhibir la replicación viral (Cocchi et al., 1995. Science, 270: 1811-1815). 4) El descubrimiento de que el receptor de quimioquina CXCR4 era necesario para la entrada del virus (Bleul et al., 1996. Nature, 382: 829-833). 5) Los sujetos homocigotos para la deleción Δ32 en el gen que codifica para el receptor CCR5 son resistentes a la infección, y los heterocigotos, aunque susceptibles, experimentan un curso más lento en su historia natural (Huang et al., 1996. Nat Med., 2: 1240-1243). Estos estudios seminales han ido forjando un sólido cuerpo de doctrina sobre el tropismo viral de gran relevancia patogénica, clínica y terapéutica, que han culminado con la reciente aprobación, por parte de las Agencias Reguladoras de Medicamentos, de Maraviroc (MRV), el primer antagonista de correceptores de quimioquinas CCR5 que ha demostrado eficacia clínica. Ello exige la determinación previa del tropismo viral.
Para determinar el tropismo del virus VIH en pacientes infectados existen diferentes herramientas genotípicas y fenotípicas (Berger et al., 1998. Nature, 391: 240). Braun y Wiesmann (2007) muestran una revisión de los métodos fenotípicos existentes para la identificación del tropismo vírico presente en los pacientes infectados por el VIH. En dicha revisión se analizan las características así como las ventajas e inconvenientes de cada uno de ellos (Braun y Wiesmann, 2007. Eur J Med Res., 12(9): 463-472).
Los algoritmos genotípicos no tienen suficiente sensibilidad y su valor predictivo es limitado (Low et al., 2007. AIDS, 21: F17-24; Huang et al., 2008. Protein J Virol., 82: 5584-5593; de Mendoza et al., 2008. J Acquir Immune Defic Syndr., 48: 241-244). Otra aproximación genotípica es la secuenciación "ultra deep", pero esta técnica es cara y no aplicable en la práctica clínica (Archer et al., 2009. AIDS, 23: 1209-1218).
El ensayo fenotípico más ampliamente utilizado y el único validado clínicamente para la determinación del tropismo vírico es Trofile® (Whitcomb et al., 2007. Antimicrob Agents Chemother., 51: 556-575), basado en la generación de virus recombinante de ciclo único, pero aunque es un ensayo validado clínicamente, tiene algunas limitaciones, como su elevado coste, dificultades técnicas, el tiempo hasta la obtención de un resultado ya que sólo se realiza en USA (Monogram Biosciences Inc., South San Francisco, CA) y esto exige el trasporte de la muestra con lo que el resultado final puede tardar entre 4-6 semanas, su acceso es muy limitado para países en desarrollo por su elevado coste y sin apoyo logístico para el transporte de muestras, entorno al 20% los resultados suministrados por el ensayo son indeterminados ("no reportables"), generalmente para que el ensayo funcione se requiere que la viremia del paciente sea superior a 1000 copias de RNA vírico/ml, lo que limita el uso de MRV en pacientes con viremias más bajas, que están en fracaso virológico y con escasas opciones terapéuticas, en diferentes estudios (Wilkin et al., 2007. Clin Infect Dis., 44: 591-595; Kitrinos et al., 2009. Antimicrob Agents Chemother., 53: 1124-1131; Landovitz et al., 2008. J Infect Dis., 198: 1113-1122), se ha observado que entorno al 10% de los pacientes, presentan un "cambio" de tropismo (de R5 a dual/mixto, o X4), entre dos muestras separadas en torno a un mes, probablemente debido a problemas de sensibilidad de la técnica, lo que genera incertidumbre sobre la reproductibilidad del Trofile® en algunos pacientes, si el resultado es clasificado como "dual/mixto", el ensayo no suministra información sobre la proporción de cuasiespecies R5 y X4, cuando ya ha sido comunicado (Irlbeck et al., 2008. AIDS, 22: 1425-1431) que estos pacientes tienen una distribución de tropismos heterogénea, con claro predominio de R5, algunos de los cuales quizás pudieran beneficiarse del tratamiento con MRV (Harrigan et al., 2009. 16th CROI Abstract MHLB0311). Se ha comunicado también que el 7% de sujetos nunca expuestos a quimiantagonistas y con tropismo R5, presentan mutaciones de resistencia a MRV en la región V3 (Soulie et al., 2008. AIDS, 22: 2212-2214). Así, estos pacientes podrían ser inadecuadamente tratados con MRV, en base al resultado del Trofile®.
Aunque el ensayo fenotípico Trofile® aporta información para la determinación del tropismo del VIH en pacientes infectados, persiste el problema de la determinación precisa de las cuasiespecies virales y de sus proporciones relativas mediante un método que sea, además, de bajo coste, sencillo y que solucione los inconvenientes que se han descrito en el estado de la técnica.
Explicación de la invención
La presente invención se refiere a un método de identificación del tropismo del VIH en un paciente infectado con dicho virus que comprende el cocultivo de PBMCs de un paciente infectado con el VIH y PBMCs de un sujeto control sano, donde las células PBMCs CD8 positivas del paciente infectado con VIH y/o del sujeto control sano han sido previamente eliminadas de manera selectiva. Los viriones liberados al medio de cultivo son inoculados mediante espinoculación a al menos dos líneas celulares humanas aisladas, CD4 positivas, una de las cuales expresa el correceptor CCR5, pero no el CXCR4 (CD4+/CCR5+/CXCR4-) y otra que expresa el correceptor CXCR4, pero no el CCR5 (CD4+/CCR5-/CXCR4+). Dicho método permite determinar el tropismo viral mediante la cuantificación de la proporción de cuasiespecies víricas que utilizan uno u otro correceptor. Además, el método descrito se emplea para determinar mediante el conocimiento del tropismo del VIH de un paciente infectado, si es tributario al tratamiento con antagonistas de CCR5.
La presente invención provee un nuevo método para el ensayo de tropismo fenotípico. En adelante, para referirse al método de la presente invención, se utilizará indistintamente el acrónimo TROCAI, (del inglés Tropism Correceptor Assay Information). Los resultados de TROCAI se interpretaron y clasificaron según la respuesta virológica a una exposición a corto plazo a Maraviroc (Prueba Clínica del Maraviroc, MCT). Finalmente, se compararon los resultados de TROCAI con los obtenidos mediante TROFILE® de segunda generación ó TROFILE® (ES) y diferentes algoritmos genotípicos. En adelante, para referirse a TROFILE® (ES) se pueden emplear indistintamente los términos "Trofile" o "Trofile®".
Tal como se describe en los ejemplos de realización de la presente invención, los resultados obtenidos por TROCAI mostraron una coincidencia de 22/24 (91,6%) con TROFILE® (ES) y de 22/26 (84,6%) con los ensayos genotípicos. Con el método TROCAI se consiguieron resultados en 27/27 (100%) de pacientes con cargas víricas superiores a 500 copias/ml de ARN de VIH y en 3/6 (50%) de pacientes con cargas víricas inferiores a 500 copias/ml de ARN de VIH. TROCAI mostró menos de un 0,5% de variantes X4 en el sobrenadante de la línea celular indicadora X4 en todos los pacientes positivos a MCT y más de un 0,5% de variantes X4 en el sobrenadante de la línea celular indicadora X4 en todos los pacientes negativos a MCT.
El método...
Reivindicaciones:
1. Método de identificación del tropismo del virus VIH en un paciente infectado con dicho virus que comprende:
2. Método según la reivindicación 1, donde las células CD4+/CCR5+/CXCR4- y CD4+/CCR5-/CXCR4+ inoculadas en el paso (c) se cultivan durante un tiempo de entre 5 y 7 días.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde las células PBMCs del paciente infectado con el virus VIH proceden de un paciente con una carga vírica plasmática menor o igual a 103 copias de RNA del virus VIH por mL.
4. Método según la reivindicación 3, donde las células PBMCs del paciente infectado con el virus VIH proceden de un paciente con una carga vírica plasmática menor o igual a 500 copias de RNA del virus VIH por mL.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde se añade al menos una proteína lectina a las células PBMCs del paciente infectado y/o a las células PBMCs del sujeto control sano del paso (a), en el cocultivo y/o previamente a dicho cocultivo.
6. Método según la reivindicación 5, donde la lectina es fitohematoglutinina.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el porcentaje de células PBMCs del sujeto control sano al inicio del cocultivo del paso (a) es de entre 25 y 75% respecto del total de células PBMCs.
8. Método según la reivindicación 7, donde dicho porcentaje es de entre 50 y 75%.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la cantidad total de células PBMCs en el cocultivo del paso (a) es de entre 15x106 y 20x103.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el medio de cultivo de las células CD4+/CCR5+/ CXCR4- y/o el de las células CD4+/CCR5-/CXCR4+ del paso (d) se renueva tras un periodo de tiempo de entre 2 y 4 días desde la inoculación del virus.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde las células humanas CD4+/CCR5+/CXCR4- y CD4+/CCR5-/CXCR4+ son de la línea celular de astrocitoma U87.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para determinar el tropismo del virus VIH de un paciente infectado con el objeto de conocer si dicho paciente es tributario a un tratamiento con al menos un antagonista de CCR5.
13. Método según la reivindicación 12, donde el antagonista de CCR5 es Maraviroc.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde el paciente tributario tiene tropismo viral R5 si la concentración de copias de las partículas virales liberadas de las células CD4+/CCR5-/CXCR4+ es menor de 0,5% respecto del número total de copias de las partículas virales liberadas de las células CD4+/CCR5-/CXCR4+ y CD4+/CCR5 +/CXCR4-.
15. Método según la reivindicación 14, donde la concentración de copias de partículas virales liberadas de las células CD4+/CCR5-/CXCR4+ es menor de 3x103 copias de RNA del virus VIH por mL.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde el paciente tributario tiene tropismo viral dual si la concentración de copias de partículas virales liberadas de las células CD4+/CCR5-/CXCR4+ es igual o mayor de 0,5% respecto del número total de copias de las partículas virales liberadas de las células CD4+/CCR5-/CXCR4+ y CD4+/CCR5+/CXCR4-.
17. Método según la reivindicación 16, donde la concentración de copias de las partículas virales liberadas de las células CD4+/CCR5-/CXCR4+ es igual o mayor de 5,5x104 copias de RNA del virus VIH por mL.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde las células PBMCs se han congelado junto con un criopreservante previamente al cocultivo del paso (a).
19. Método según la reivindicación 18, donde el criopreservante comprende suero bovino fetal y dimetil sulfóxido.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde la cuantificación de la proporción de cuasiespecies víricas que utilizan uno u otro correceptor del paso (e), se lleva a cabo mediante PCR cuantitativa.
21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, donde el virus VIH es VIH-1.
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