Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer que emplea sfrp1 como biomarcador.

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer que comprende (a) detectar y/o cuantificar el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 en una muestra aislada; (b) comparar la cantidad detectada y/o cuantificada con una cantidad de referencia; (c) identificar cualquier desviación significativa en la comparación de datos de la etapa (b); y, (d) atribuir la desviación significativa identificada a la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Así mismo, la presente invención se refiere al uso de un kit que comprende cebadores y/o sondas que hibridan con la secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 o anticuerpos que se unen específicamente a una secuencia aminoacídica codificada por la secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 para determinar la presencia de una enfermedad de Alzheimer.

Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer que emplea Sfrp1 como biomarcador.

La presente invención pertenece al campo de la Biología Molecular y se refiere a Sfrp1 como biomarcador para la enfermedad de Alzheimer en su etapa más temprana y a su uso para el diagnóstico precoz de dicha enfermedad.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa que se manifiesta con un deterioro cognitivo y trastornos conductuales. Se caracteriza por una pérdida progresiva de la memoria y de otras capacidades mentales asociadas a la muerte neuronal en distintas zonas del cerebro. La EA es incurable y terminal. Su diagnostico se realiza mediante evaluaciones de conducta y cognitivas, mediante análisis por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) o Tomografía por Emisión de Positrones (PET) . Las causas de la EA son en gran medida desconocidas. La enfermedad se caracteriza por la aparición de placas seniles que contienen acumulaciones anómalas de, entre otros, él péptido conocido como beta amiloide (Aº) , que se genera por el procesamiento de la proteína precursora del amiloide (APP) (Tanzi, RE, Bertram, L. 2005 Cell,

120: 545-555) .

Actualmente, los únicos marcadores descritos son el péptido Aº, la proteína tau total y la proteína tau fosforilada en la posición 181. Sin embargo, supone un gran reto encontrar nuevos biomarcadores en líquido cefalorraquídeo o sangre (Humpel, C. 2011. Trends Biotechnol. 29 (1) : 26–32) , ya que no existen marcadores capaces de predecir la susceptibilidad de un individuo de padecer EA, con la excepción en los casos de EA familiar, ni tampoco marcadores para determinar qué pacientes con un deterioro cognitivo leve van a desarrollar EA. Por lo tanto, es urgente desarrollar nuevos biomarcadores para el diagnóstico precoz de la EA. La EA a menudo pasa desapercibida o se diagnostica incorrectamente en sus primeras etapas, a menudo porque sus síntomas se confunden con las inevitables consecuencias del envejecimiento. Cuando la enfermedad progresa, el diagnóstico clínico puede hacerse con sólo el 65-90 % de precisión. El diagnóstico definitivo de la EA solo se hace post mortem, cuando la autopsia revela las placas seniles y los ovillos neurofibrilares en el tejido cerebral. Las placas son el resultado de la agregación de péptidos Aº y se cree que participan en la patología de la EA. (Hardy, J, Selkoe, DJ. 2002. Science, 297: 353-356) .

La identificación de un biomarcador de la EA para el diagnóstico temprano de la EA es un primer paso crítico en el desarrollo de metodologías para la intervención temprana de la enfermedad, y tendría varias ventajas. Sería capaz de identificar la EA en una etapa muy temprana de la enfermedad, antes de que los síntomas cognitivos puedan detectarse en pruebas neuropsicológicas, y antes de que los análisis de las imágenes cerebrales de RMN o PET puedan mostrar signos de degeneración. El diagnóstico diferencial de la EA es difícil, y un biomarcador que refleje cambios neuropatológicos a nivel molecular en el cerebro podría permitir distinguir los pacientes de Alzheimer no sólo de las personas con leve deterioro cognitivo que no desarrollan EA, sino también de pacientes con depresión. Un biomarcador también contribuiría en gran medida a la detección de nuevas terapias, especialmente las dirigidas a prevenir cambios neuropatológicos. Hasta ahora, la EA no se puede diagnosticar por un método clínico válido o por un biomarcador antes de que la enfermedad haya progresado tanto que la demencia sea evidente. Además, no hay un método válido para determinar qué pacientes con un deterioro cognitivo leve desarrollarán EA. Por lo tanto, un correcto diagnóstico en la fase precoz de la EA no solo es de gran importancia porque el tratamiento temprano es más eficaz, sino también porque la carga psicológica de los pacientes y familiares puede aliviarse antes.

Se han investigado muchos marcadores bioquímicos ante mortem para la EA, tanto en plasma como en orina, pelo, piel y otros, pero aún no se ha encontrado ninguno que permita monitorizar la eficacia de nuevos medicamentos o estrategias terapéuticas en ensayos clínicos.

Debido a que la EA queda a menudo sin diagnosticar o se diagnostica mal, es muy importante identificar un marcador biológico robusto y fácil de medir, especialmente uno que permita la detección temprana de la enfermedad. Esto podría permitir la intervención temprana y el tratamiento terapéutico para restaurar potencialmente la memoria y detener la deposición del péptido Aº para así prevenir la neurodegeneración (Ward, M. 2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 635–646) .

APP es una proteína integral de membrana que está presente en muchos tipos de tejidos, pero que es particularmente abundante en las sinapsis neuronales. APP puede sufrir dos tipos alternativos de procesamiento que son excluyentes entre sí. El procesamiento no amiloidogénico de la proteína APP lo realiza ADAM10, una metaloproteasa con actividad a-secretasa, que corta APP dentro del péptido Aº, más concretamente en el aminoácido 16 de APP, provocando la liberación del dominio extracelular soluble de APP (sAPPa) e impidiendo la generación del péptido tóxico Aº. Posteriormente, APP es procesada por una ysecretasa, generándose unos péptidos llamados p3. Alternativamente, APP puede sufrir un procesamiento amiloidogénico, realizado por una º-secretasa que corta en un extremo del péptido Aº. Este péptido es de nuevo procesado por la y-secretasa y da lugar a los péptidos tóxicos Aº. (Lichtenthaler, SF. 2011. J Neurochem. 116:10-21) .

Las proteínas SFRPs (del inglés “secreted Frizzled related proteins”) son proteínas secretables conocidas por su actividad como moduladores de la vía de señalización de Wnt (nombre derivado de los genes “Wingless” e “int”) , y también por su capacidad para regular la actividad de metaloproteasas de tipo “Tolloid” (Bovolenta, P et al. 2008 .J Cell Science 121 (6) :737-46 ) .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de SFRP como biomarcador para la enfermedad de Alzheimer (EA) .

Los autores de la presente invención han demostrado que algunas proteínas de la familia SFRP presentan niveles alterados en muestras de fluidos biológicos procedentes de enfermos de Alzheimer respecto de personas sanas. Por tanto, la presente invención supone un nuevo biomarcador para la detección precoz de la EA.

Como muestran los ejemplos de la presente invención, los niveles de la proteína SFRP1 están alterados en sujetos enfermos de Alzheimer con respecto a sujetos control. De esta forma, la detección y/o cuantificación de esta proteína permite el diagnóstico temprano de la enfermedad de Alzheimer.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico de la EA o para la determinación del riesgo de padecer EA o para la determinación de la evolución de una EA en un sujeto susceptible de padecer EA que comprende las siguientes etapas:

a) detectar y/o cuantificar el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 en una muestra aislada;

b) comparar la cantidad detectada y/o cuantificada en la etapa (a) con una cantidad de referencia;

c) identificar cualquier desviación significativa en la comparación de datos de la etapa (b) ; y,

d) atribuir la desviación significativa identificada en la etapa (c) a la presencia de la EA o al riesgo de padecer EA.

El término “determinación de la evolución”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere, a la supervisión del desarrollo de la enfermedad, como por ejemplo, pero sin limitarse, la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento.

El término “producto de expresión”, tal y como se utiliza en la presente descripción, hace referencia al producto resultante de la transcripción (síntesis de ARN) o de la traducción (síntesis de la proteína) de un gen

o de una secuencia nucleotídica de ADN, o a cualquier forma resultante del procesamiento del producto resultante de la transcripción o de la expresión de un gen o de una secuencia nucleotídica de ADN.

El gen sfrp1 es el gen de la “secreted Frizzled related protein 1”.

La detección de la etapa (a) , tal y como es entendida por un experto... [Seguir leyendo]

1. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer que comprende las siguientes etapas:

a) detectar y/o cuantificar el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 en una muestra aislada;

b) comparar la cantidad detectada y/o cuantificada en la etapa (a) con una cantidad de referencia;

c) identificar cualquier desviación significativa en la comparación de datos de la etapa (b) ; y,

d) atribuir la desviación significativa identificada en la etapa (c) a la presencia de la enfermedad de Alzheimer o al riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer.

2. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación anterior donde la secuencia nucleotídica del gen sfrp1 codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1.

3. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores donde la secuencia nucleotídica del gen sfrp1 codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:

1.

4. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores donde la muestra aislada de la etapa (a) es un fluido biológico.

5. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación anterior donde el fluido biológico es líquido cefalorraquídeo, sangre, suero o plasma sanguíneo.

6. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación anterior donde el fluido biológico es suero sanguíneo.

7. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación anterior donde el fluido biológico es líquido cefalorraquídeo.

8. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según las reivindicaciones 1 a 3, donde la muestra aislada comprende células.

9. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según las reivindicaciones 1 a 3, donde la muestra aislada comprende un tejido.

10. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 es una secuencia aminoacídica con al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1.

11. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 10 donde el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 es la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

12. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el producto de expresión es detectado por PCR.

13. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde el producto de expresión es detectado por electroforesis, inmunoensayo, cromatografía, tecnología de microarrays y/o espectrometría de masas.

14. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 13 donde el producto de expresión es detectado por inmunoensayo.

15. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 14 donde el inmunoensayo es un ELISA.

16. Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o para la determinación del riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer o para la determinación de la evolución de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 13 donde el producto de expresión es detectado por espectrometría de masas.

17. Uso del producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 como marcador para la determinación del riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer, para determinar la presencia de la enfermedad de Alzheimer y/o para predecir la progresión de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer.

18. Uso de un kit que comprende cebadores y/o sondas que hibridan con la secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 que codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1, o que codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, para determinar el riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer o para determinar la presencia de una enfermedad de Alzheimer o para predecir la progresión de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer, en una muestra aislada.

19. Uso de un kit que comprende anticuerpos que se unen específicamente a una secuencia aminoacídica codificada por la secuencia nucleotídica de un gen sfrp1 donde dicha secuencia aminoacídica tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 1, o donde dicha secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1, para determinar el riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer o para determinar la presencia de una enfermedad de Alzheimer o para predecir la progresión de una enfermedad de Alzheimer en un sujeto susceptible de padecer enfermedad de Alzheimer, en una muestra aislada.

FIG. 1

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas Vall d´Hebron Institute of Oncology Institució Catalana de Recerca i Estudis Avancats Vall d'Hebron Institut de Recerca National University of Singapore

<120> Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer que emplea sfrp1 como biomarcador

<130> ES1641.685

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 314

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Gly Ile Gly Arg Ser Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Leu Gly 1 5 10 15

Val Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Val Gly Ser Ala Ser 20 25 30

Glu Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gln Ser Asp Ile Gly Pro Tyr Gln Ser 35 40 45

Gly Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gln Cys Val Asp Ile Pro Ala Asp 50 55 60

Leu Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn 65 70 75 80

Leu Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gln Gln Ala Ser Ser 85 90 95

Trp Val Pro Leu Leu Asn Lys Asn Cys His Ala Gly Thr Gln Val Phe 100 105 110

Leu Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro Ile Tyr Pro 115 120 125

Cys Arg Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Met 130 135 140

Gln Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe 145 150 155 160

Pro Glu Gly Asp Val Cys Ile Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala Thr Glu 165 170 175

Ala Ser Lys Pro Gln Gly Thr Thr Val Cys Pro Pro Cys Asp Asn Glu

180 185 190

Leu Lys Ser Glu Ala Ile Ile Glu His Leu Cys Ala Ser Glu Phe Ala 195 200 205

Leu Arg Met Lys Ile Lys Glu Val Lys Lys Glu Asn Gly Asp Lys Lys 210 215 220

Ile Val Pro Lys Lys Lys Lys Pro Leu Lys Leu Gly Pro Ile Lys Lys 225 230 235 240

Lys Asp Leu Lys Lys Leu Val Leu Tyr Leu Lys Asn Gly Ala Asp Cys 245 250 255

Pro Cys His Gln Leu Asp Asn Leu Ser His His Phe Leu Ile Met Gly 260 265 270

Arg Lys Val Lys Ser Gln Tyr Leu Leu Thr Ala Ile His Lys Trp Asp 275 280 285

Lys Lys Asn Lys Glu Phe Lys Asn Phe Met Lys Lys Met Lys Asn His 290 295 300

Glu Cys Pro Thr Phe Gln Ser Val Phe Lys 305 310