Un método para cultivar células madre embrionarias humanas en un estado indiferenciado sobre una matriz sin necesidad de células alimentadoras o medio acondicionado,

método que comprende la etapa de cultivar células madre embrionarias humanas en un medio en ausencia de células alimentadoras y medio acondicionado, en que el medio comprende sales, vitaminas, aminoácidos, glucosa, un factor de crecimiento de fibroblastos, factor de transformación del crecimiento beta y al menos dos de los ácidos gamma amino butíricos, ácido pipecólico y litio o un sustituto del litio que estimule la vía de señalización del Wnt en cantidades suficientes para mantener las células embrionarias humanas en un estado indiferenciado a través de pases de cultivo sucesivos múltiples.

Medio de cultivo y cultivo de células madre embrionarias.

Antecedentes de la invención

Las células madre se definen como células capaces de diferenciarse en otros muchos tipos de células diferenciadas. Las células madre embrionarias son células madre procedentes de embriones que son capaces de diferenciarse en la mayoría, si no todos, de los tipos celulares diferenciados de un cuerpo adulto. Las células madre se describen como pluripotenciales, lo que hace referencia a su capacidad para diferenciarse en múltiples tipos celulares. Un tipo de célula precursora pluripotencial de gran interés para la comunidad investigadora es la célula madre embrionaria humana, nombrada en este documento célula ES, que es una célula precursora embrionaria derivada de una fuente embrionaria humana. Los células madre embrionarias humanas son de gran interés científico porque son capaces de proliferar indefinidamente en medios de cultivo y así son capaces, al menos en principio, de proporcionar células y tejidos que permitan reemplazar tejidos humanos defectuosos. La existencia de células madre embrionarias humanas en cultivos ofrece el potencial de cantidades ilimitadas de células y tejidos humanos para su empleo en una gran variedad de procedimientos terapéuticos de ayuda para la salud humana. Se prevé que en el futuro los células madre embrionarias humanas se reproducirán y se orientarán a diferenciarse en distintos linajes de forma que se desarrollen células o tejidos diferenciados que puedan trasplantarse en seres humanos con fines terapéuticos. Los células madre embrionarias humanas y las células diferenciadas que pueden derivarse de ellas son también herramientas muy potentes para el estudio de los sistemas celulares y de desarrollo humanos.

Se han descrito las técnicas básicas para crear y cultivar células madre embrionarias humanas. Las técnicas descritas previamente funcionan, pero muchos de los procedimientos usados actualmente para cultivar células madre embrionarias humanas tienen limitaciones e inconvenientes. Una de las limitaciones presenta una objeción especial. La mayoría de las líneas de células madre embrionarias humanas existentes han sido, en mayor o menor grado, expuestas directamente a células de ratón o a un medio en el que se han cultivado previamente células de ratón. Por parte de la prensa, se prestó gran atención al hecho de que se encontrasen algunas células ES humanas de líneas celulares existentes que exhiben el residuo siálico Neu5Gc, residuo que no es sintetizado normalmente por células humanas. Las técnicas originales para la generación y el cultivo de células madre embrionarias humanas requerían del uso de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF, del inglés Mouse Embr y onic Fibroblast) como una capa alimentadora en la que los células madre embrionarias humanas podían ser cultivadas. Las células alimentadoras de fibroblastos actúan, a través de un mecanismo que no se comprende completamente todavía, de forma que fomentan que las células madre permanezcan en un estado indiferenciado. Posteriormente, se descubrió que este mismo efecto podía conseguirse si las células madre se exponían a "medios acondicionados". Un medio acondicionado es un medio de cultivo de células madre en el que las células alimentadoras, como las MEFs, habían sido cultivadas previamente. Ya sea porque las células alimentadoras proporcionaban un factor al medio o porque eliminaban un factor del medio, el resultado es que el medio acondicionado puede utilizarse para cultivar células madre sin diferenciación. Ya sea por las características del cultivo, el crecimiento directo de células ES humanas en células alimentadoras murinas, o por el uso de un medio acondicionado, surge la preocupación de que uno o más agentes infecciosos, como un virus, podrían transmitirse de las células de ratón a los células ES humanas. Si uno de los objetivos de los cultivos de células madre embrionarias humanas es crear tejidos que en última instancia puedan transplantarse a un cuerpo humano, es sumamente deseable que las células madre nunca hayan sido expuestas a células de otras especies o a medios que hayan sido utilizados para cultivar células de otras especies. En consecuencia, definir las condiciones de cultivo que permitirán la proliferación y el cultivo de células madre embrionarias humanas sin la capa alimentadora de fibroblastos, es de gran interés en el desarrollo continuo de técnicas para el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias humanas.

Un rasgo característico de células madre embrionarias humanas en el cultivo es que si las condiciones están por debajo de las óptimas, las células tienden a diferenciarse. Es fácil inducir a los células ES humanas a diferenciarse aunque existe la necesidad de mantener los células ES en un cultivo en estado indiferenciado. La mayoría de las condiciones de cultivo llevan a cierto grado de diferenciación no deseada, particularmente en torno a la periferia de la colonia de células ES en crecimiento. Aunque los células ES pueden cultivarse con cierto grado de diferenciación no deseada, el objetivo es definir unas condiciones de cultivo que permitan al cultivo permanecer tan indiferenciado como sea posible, es decir con el mínimo de células diferenciadas posible. El solicitante cree que se han utilizado estándares especialmente restrictivos para definir las condiciones de cultivo indefinido para cultivos de células ES indiferenciadas.

Varias formulaciones de medios de cultivo permiten que los células ES permanezcan indiferenciadas durante cierto tiempo, pero este estado falla a menudo en automantenerse. En particular, el solicitante ha definido el crecimiento de células ES humanas desde un estado de siembra inicial en un recipiente de cultivo hasta la confluencia en el mismo recipiente de cultivo como un pase. El solicitante ha encontrado varias formulaciones de medios que permiten el cultivo de células ES humanas en uno o dos pasos sin diferenciación estricta, pero posteriormente las células se diferencian rápidamente durante pases sucesivos. El solicitante entiende que para que un medio de cultivo verdaderamente permita la proliferación indefinida de células ES humanas sin diferenciación, en ausencia de medios acondicionados o células de fibroblastos alimentadoras, debe demostrarse que el medio puede mantener el cultivo de células ES humanas en un estado sustancialmente uniforme e indiferenciado durante al menos cinco pases. También es importante que los cultivos permanezcan relativamente homogéneos e indiferenciados durante el periodo de cultivo y mantengan todas las características significativas de las células ES humanas.

El estado de diferenciación de un cultivo de células madre puede evaluarse más fácilmente valorando las características morfológicas de las células. Las células madre indiferenciadas tienen una morfología característica, es decir son células pequeñas y compactas con bordes celulares claramente definidos, una morfología que puede verse fácilmente mediante el examen de un cultivo de células madre en el microscopio. En cambio, las células que se han diferenciado aparecen más grandes y más difusas, con bordes poco definidos. Aunque algunas células diferenciadas pueden, y normalmente lo hacen, aparecer en el margen de las colonias de células indiferenciadas, el cultivo óptimo de células madre es aquel que prolifera en el recipiente de cultivo con un número mínimo de células que parezcan estar diferenciadas en la periferia del cultivo. Con experiencia, se puede evaluar visualmente con gran exactitud el estado de diferenciación y salud de los cultivos de células ES humanas. Un marcador bioquímico que se utiliza para seguir el estado indiferenciado de las células ES es el factor de transcripción Oct4, que se considera el marcador más fiable de estado indiferenciado de las células ES, y que es uno de los primeros marcadores que se pierde cuando las células indiferenciadas comienzan a diferenciarse.

Breve compendio de la invención La presente invención proporciona un método para cultivar células madre embrionarias humanas en un estado indiferenciado en una matriz sin la necesidad de células alimentadoras o de un medio acondicionado, donde dicho método comprende la etapa de cultivar las células madre embrionarias humanas en un medio en ausencia de células alimentadoras y de medio acondicionado, en que el medio de cultivo comprende sales, vitaminas, aminoácidos, glucosa, un factor de crecimiento de fibrobastos, factor beta de transformación del crecimiento y al menos dos de los ácidos gamma amino butíricos, ácido pipecólico y litio o un sustituto del litio que estimule la... [Seguir leyendo]

1. Un método para cultivar células madre embrionarias humanas en un estado indiferenciado sobre una matriz sin necesidad de células alimentadoras o medio acondicionado, método que comprende la etapa de cultivar células madre embrionarias humanas en un medio en ausencia de células alimentadoras y medio acondicionado, en que el medio comprende sales, vitaminas, aminoácidos, glucosa, un factor de crecimiento de fibroblastos, factor de transformación del crecimiento beta y al menos dos de los ácidos gamma amino butíricos, ácido pipecólico y litio o un sustituto del litio que estimule la vía de señalización del Wnt en cantidades suficientes para mantener las células embrionarias humanas en un estado indiferenciado a través de pases de cultivo sucesivos múltiples.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo comprende un factor de crecimiento de fibroblastos en una concentración de al menos 40 ng/ml.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el medio de cultivo comprende un factor de crecimiento de fibroblastos en una concentración de al menos 100 ng/ml.

4. El método de las reivindicaciones 1, 2 y 3 en el que el medio de cultivo comprende transferrina e insulina.

5. Un medio de cultivo celular in vitro que comprende en un recipiente de cultivo:

células madre embrionarias humanas una matriz en que las células madre pueden crecer; y un medio de cultivo, medio de cultivo que comprende sales, vitaminas, amino ácidos, glucosa, un factor beta de crecimiento de fibroblastos y al menos dos de los ácidos gamma amino butíricos, ácido pipecólico y litio o un sustituto del litio que estimule la vía de señalización del Wnt en cantidades suficientes para mantener las células madre embrionarias humanas en un estado indiferenciado durante múltiples pases de cultivo, en que el medio está libre de células alimentadoras y nunca ha sido expuesto a células alimentadoras.

6. Un cultivo celular según la reivindicación 5, en que el medio comprende un factor de crecimiento de fibroblastos en una concentración de al menos 40 ng/ml.

7. Un cultivo celular según la reivindicación 6, en que el medio comprende un factor de crecimiento de fibroblastos en una concentración de al menos 100 ng/ml.

8. Un cultivo celular según las reivindicaciones 5, 6 o 7, en el que el medio también comprende proteínas seleccionadas del grupo que consiste en albúmina, insulina y transferrina.

9. Un cultivo celular según la reivindicación 8, en el que las proteínas son humanas.

10. Un cultivo celular según la reivindicación 9, en el que la insulina y la transferrina son proteínas recombinantes.

11. Un cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que las células madre embrionarias humanas son positivas en al menos un 90% para el factor de transcripción Oct4 tras pases de cultivo múltiples.

12. Un cultivo de células madre embrionarias humanas como el reivindicado en la reivindicación 11, en el que las células no exhiben el resto de ácido siálico Neu5Gc.

13. Un medio de cultivo de células madre embrionarias indiferenciadas, en que el medio comprende sales, vitaminas, aminoácidos, glucosa, un factor de crecimiento de fibroblastos, un factor beta de transformación de crecimiento de fibroblastos y al menos dos de los ácidos gamma amino butíricos, ácido pipecólico y litio o un sustituto del litio que estimule la vía de señalización del Wnt en cantidades suficientes para mantener las células madre creciendo en el medio de cultivo en un estado indiferenciado a través de múltiples pases por cultivo.

14. El medio de la reivindicación 13, en la que el medio de cultivo además comprende proteínas seleccionadas del grupo que consiste en albúmina, insulina y transferrina.