Un método para estabilizar un medio de alimentación concentrado para alimentar un cultivo de células de mamífero que comprende incluir en el medio de alimentación piruvato a una concentración de al menos aproximadamente 25 mM,

donde el medio de alimentación comprende cisteína y/o cistina, donde la suma de las concentraciones de cisteína y/o cistina es de al menos aproximadamente 7, 9 mM, donde el pH del medio de alimentación es de aproximadamente 5, 8 a aproximadamente 7, 4, donde el medio de alimentación comprende tirosina y la concentración de tirosina no es más de aproximadamente 4, 4 mM, y donde el medio de alimentación con el piruvato incluido es estable a temperatura ambiente durante al menos aproximadamente 1 semana.

Medios de alimentación mejorados

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

La presente invención reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Nº 60/917.569, presentada el 11 de mayo del 2007.

Campo de la invención

La invención se encuentra en el campo de los medios y métodos de cultivo celulares.

Antecedentes de la invención

Los cultivos de alimentación discontinua a gran escala de células de mamífero, especialmente células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , se utilizan ampliamente para producir proteínas usadas en diversas aplicaciones, tales como para el uso en diagnósticos, terapia e investigación. Se ha prestado una particular atención a las células CHO porque se han caracterizado de manera extendida y las agencias reguladoras han autorizado su uso en la fabricación clínica. Tales cultivos se conservan normalmente durante días, o incluso semanas, al mismo tiempo que las células producen la proteína (o proteínas) deseada. Durante este tiempo, el cultivo puede complementarse con un medio de alimentación que contenga componentes, tales como nutrientes y aminoácidos, que se consumen durante el cultivo. Se ha demostrado que dicha alimentación mejora la producción de proteínas a través de un cultivo de células de mamífero. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.672.502. Incluso, mejoras incrementales en la producción de proteínas pueden ser valiosas, dado el gasto y la dificultad de desarrollar y obtener autorización regulatoria para instalaciones de cultivo comercial a gran escala.

En procedimientos de cultivo de alimentación discontinua frecuentemente se usan medios de alimentación concentrados para mejorar la valoración de las proteínas, el crecimiento y/o la viabilidad celular. Algunos componentes presentes a alta concentración en los medios de alimentación pueden precipitar durante la conservación, especialmente cuando el pH del medio es casi neutro. La precipitación de los componentes del medio durante el almacenamiento antes del uso de un medio es muy indeseable debido a que esto añade un elemento de incertidumbre. Cuando los componentes del medio precipitan, se desconocerá la concentración de los componentes del medio en solución, frente a la concentración en el precipitado. Dado que las concentraciones de diversos componentes del medio pueden influir en la cantidad y calidad de una proteína producida por un cultivo, esto es un elemento de incertidumbre que es muy indeseable en un procedimiento de cultivo comercial, en el que las condiciones de cultivo se controlan, óptimamente, de manera escrupulosa. Además, los procedimientos comerciales pueden someterse a una revisión reguladora rigurosa. Por tanto, medios de alimentación con altas concentraciones de aminoácidos que puedan conservarse durante un período de tiempo sin precipitar, proporcionarían ventajas significativas.

El documento WO 03/10661 describe un medio de cultivo celular para el cultivo de células de mamífero.

Explicación de la invención

La invención proporciona medios de alimentación estables que contienen piruvato, métodos que, para estabilizar los medios de alimentación, comprenden añadir piruvato a un medio, métodos para el uso de medios de alimentación estables y proteínas producidas por cultivos alimentados con un medio de la invención.

En una realización, la invención incluye un método para estabilizar un medio de alimentación concentrado para su uso en la alimentación de un cultivo de células de mamífero que comprende añadir al medio de alimentación piruvato a una concentración de al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 mM, en el que el medio de alimentación puede comprender cisteína y/o cistina, en el que la suma de las concentraciones de cisteína y/o cistina puede ser de al menos aproximadamente 7, 9 mM, en el que el pH del medio de alimentación puede ser de aproximadamente 5, 8 a aproximadamente 7, 4, en el que el medio de alimentación puede comprender tirosina a una concentración de no más de aproximadamente 4, 4 mM y en el que el medio puede ser estable a temperatura ambiente durante al menos aproximadamente 1, 2 ó 3 semanas. El piruvato puede ser piruvato sódico. El pH del medio de alimentación puede ser de aproximadamente 6, 0 a aproximadamente 7, 2 y/o de al menos aproximadamente 6, 3, 6, 4, 6, 5, 6, 6, 6, 7 ó 6, 8 y no más de aproximadamente 7, 4. El medio de alimentación puede comprender cisteína a una concentración de al menos aproximadamente 5, 0, 6, 0, 7, 0, 12, 0, 21, 0, 35, 0, 40, 0 ó 45, 0 mM y/o una concentración de cistina de al menos aproximadamente 0, 5, 1, 0, 1, 5, 2, 0 ó 4, 0 mM. El medio de alimentación puede comprender una concentración de cisteína de aproximadamente 7 mM a aproximadamente 16 mM o de aproximadamente 7, 5 mM a aproximadamente 13 mM. El medio de alimentación puede comprender tirosina a una concentración de al menos aproximadamente 2, 3 ó 4 mM. El medio de alimentación puede comprender un hidrolizado de proteína y puede ser asérico. La osmolaridad del medio de alimentación puede ser de aproximadamente 200 mOsm a aproximadamente 1300 mOsm, de aproximadamente 250 mOsm a aproximadamente 1000 mOsm, de aproximadamente 200 mOsm a aproximadamente 500 mOsm, de aproximadamente 500 mOsm a aproximadamente 1000 mOsm, de aproximadamente 700 a aproximadamente 900 mOsm, de aproximadamente 270 mOsm a aproximadamente 900 mOsm, de aproximadamente 300 mOsm a aproximadamente 830 mOsm, o de aproximadamente 200 mOsm a aproximadamente 400 mOsm. El cultivo de células de mamífero puede contener células CHO.

En otra realización, la invención proporciona un método para estabilizar un medio de alimentación que comprende añadir piruvato a un medio de alimentación a una concentración de aproximadamente 30 a 40 mM que puede comprender (a) una concentración de tirosina de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 4, 0 mM y (b) una concentración de cisteína de al menos aproximadamente 12 mM y que no comprenda cistina, y en el que el pH del medio de alimentación sea de aproximadamente 5, 8 a aproximadamente 7, 4. El pH puede ser de aproximadamente 6, 0 a aproximadamente 7, 4 y/o de al menos aproximadamente 6, 3, 6, 4, 6, 5, 6, 6, 6, 7 ó 6, 8 y no más de aproximadamente 7, 4. El medio de alimentación puede ser estable a temperatura ambiente durante al menos aproximadamente 2, 3 ó 4 semanas.

En una realización adicional, la invención comprende un medio de alimentación para un cultivo de células de mamífero que puede comprender piruvato a una concentración de al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 mM y una concentración de cisteína de al menos aproximadamente 5 mM, en el que el pH del medio de alimentación puede ser de aproximadamente 5, 8 a aproximadamente 7, 4, en el que el medio de alimentación puede comprender tirosina a una concentración de no más de aproximadamente 4, 4 mM, y en el que el medio puede ser estable a temperatura ambiente durante al menos aproximadamente 1, 2 ó 3 semanas. El piruvato puede ser piruvato sódico. El pH del medio de alimentación puede ser de aproximadamente 6, 0 a aproximadamente 7, 2 y/o al menos de aproximadamente 6, 3, 6.4, 6, 5, 6, 6, 6, 7 ó 6, 8 y no más de aproximadamente 7, 4. El medio de alimentación también puede comprender una concentración de cisteína de al menos aproximadamente 6, 7, 12, 21, 35, 40 ó 45 mM y puede comprender o no cistina (por ejemplo, a una concentración de al menos aproximadamente 0, 5, 1, 0, 1, 5, 2, 0 o 4, 0 mM) y la suma de las concentraciones de cisteína y cistina es de al menos aproximadamente 7, 9 mM. El medio de alimentación puede comprender tirosina, opcionalmente a una concentración de al menos aproximadamente 2, 3, 4 o 4, 2 mM. El medio de alimentación puede comprender un hidrolizado de proteína y puede ser asérico. La osmolaridad del medio de alimentación puede ser de aproximadamente 200 mOsm a aproximadamente 1300 mOsm, de aproximadamente 250 mOsm a aproximadamente 1000 mOsm, de aproximadamente 200 mOsm a aproximadamente 500 mOsm, de aproximadamente 500 mOsm a aproximadamente 1000 mOsm, de aproximadamente 700 mOsm a aproximadamente 900 mOsm, de aproximadamente 270 mOsm a aproximadamente 900 mOsm, de aproximadamente 300 mOsm a aproximadamente 830 mOsm o de aproximadamente 200 mOsm a aproximadamente 400 mOsm. El cultivo de células de mamífero puede ser un cultivo de células de Ovario de Hámster Chino (CHO) .

En una realización adicional, la invención incluye un medio de alimentación para un cultivo de células CHO, que puede comprender (1) una concentración de tirosina de aproximadamente... [Seguir leyendo]

1. Un método para estabilizar un medio de alimentación concentrado para alimentar un cultivo de células de mamífero que comprende incluir en el medio de alimentación piruvato a una concentración de al menos aproximadamente 25 mM, donde el medio de alimentación comprende cisteína y/o cistina, donde la suma de las concentraciones de cisteína y/o cistina es de al menos aproximadamente 7, 9 mM, donde el pH del medio de alimentación es de aproximadamente 5, 8 a aproximadamente 7, 4, donde el medio de alimentación comprende tirosina y la concentración de tirosina no es más de aproximadamente 4, 4 mM, y donde el medio de alimentación con el piruvato incluido es estable a temperatura ambiente durante al menos aproximadamente 1 semana.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende incluir en el medio de alimentación piruvato a una concentración de al menos aproximadamente 35 mM.

3. El método de reivindicación 1, que comprende incluir en el medio de alimentación piruvato a una concentración de al menos aproximadamente 30 mM.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el pH del medio de alimentación es de aproximadamente 6, 0 a aproximadamente 7, 2.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el medio de alimentación comprende al menos aproximadamente cisteína a una concentración de 6, 0 mM.

6. El método de la reivindicación 5, donde el medio de alimentación comprende cisteína a una concentración de al menos aproximadamente 12, 0 mM.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el medio de alimentación comprende tirosina a una concentración de al menos aproximadamente 3 mM.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en que el medio de alimentación es asérico.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el medio de alimentación comprende un hidrolizado proteico; el medio de alimentación tiene una osmolaridad de aproximadamente 200 mOsm a aproximadamente 1000 mOsm; y/o el medio de alimentación comprende cistina a una concentración de al menos aproximadamente 0, 5 mM

10. El método de la reivindicación 1, donde en el medio de alimentación se incluye piruvato sódico a una concentración de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mM, donde el medio de alimentación comprende tirosina a una concentración de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 4 mM, donde el medio de alimentación es estable a temperatura ambiente durante al menos aproximadamente 2 semanas, donde el medio de alimentación no comprende cistina y donde el medio de alimentación comprende cisteína a una concentración de al menos aproximadamente 12 mM.

11. Un medio de alimentación para un cultivo de células de mamífero que comprende piruvato a una concentración de al menos aproximadamente 25 mM y cisteína a una concentración de al menos aproximadamente 5 mM, donde el medio de alimentación puede comprender o no cistina, donde la suma de las concentraciones de cisteína y cistina es de al menos aproximadamente 7, 9 mM, donde el pH del medio de alimentación es de aproximadamente 5, 8 a aproximadamente 7, 4, donde la concentración de tirosina es no superior a aproximadamente 4, 4 mM, y donde medio es estable a temperatura ambiente durante al menos aproximadamente 1 semana.

12. El medio de alimentación de la reivindicación 11, donde

(a) el pH del medio de alimentación es de aproximadamente 6, 0 a aproximadamente 7, 2;

(b) el medio de alimentación comprende una concentración de cisteína de al menos aproximadamente 12, 0 mM;

(c) el medio de alimentación que comprende una concentración de tirosina de al menos aproximadamente 3 mM;

(d) el medio de alimentación es asérico; y/o

(e) el medio de alimentación tiene una osmolaridad de aproximadamente 200 mOsm a aproximadamente 1000

mOsm.

13. El medio de alimentación de las reivindicaciones 11 ó 12, donde el medio de alimentación comprende piruvato a

una concentración de al menos aproximadamente 30 mM. 5

14. El medio de alimentación de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde el cultivo de células de mamífero es un cultivo de células CHO y donde el piruvato es piruvato sódico.

15. Uso del medio de alimentación de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, para producir una proteína que

comprende cultivar en un medio de base las células de mamífero que producen la proteína, alimentar el cultivo con dicho medio y recuperar la proteína del medio de cultivo.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción