Manipulación automatizada de muestras para cristalografía de rayos.

Un procedimiento para montar una muestra que comprende un cristal para llevar a cabo un análisis por difracciónde rayos X,

comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) proporcionar un soporte del cristal (42) que contiene al menos un cristal;

(b) proporcionar una herramienta (72) capaz de recuperar dicho soporte del cristal (42);

(c) desplazar dicha herramienta mediante un robot (24);

(d) proporcionar un dispositivo de posicionamiento (12) para montar dicho soporte del cristal (42) de forma quedicho cristal esté en el camino de un haz de rayos X; y

(e) activar dicho robot (24) de forma que dicha herramienta recupere dicho soporte del cristal (42), reciba unacantidad suficiente de un fluido para mantener dicho cristal en dicho soporte del cristal (42) a una temperaturaque no supere aproximadamente 160º K, transferir dicho soporte del cristal (42) recuperado a dicho dispositivode posicionamiento (12), y montar dicho soporte del cristal (42) transferido a dicho dispositivo deposicionamiento (12), en el que dicho cristal en dicho soporte del cristal (42) recuperado se mantiene a unatemperatura que no supere aproximadamente 160º K.

Manipulación automatizada de muestras para cristalografía de rayos Antecedente de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a la cristalografía de rayos X y, en particular, a los procedimientos y aparatos para montar y alinear muestras para análisis cristalográfico mediante rayos X.

2. Discusión de la técnica

La cristalografía de rayos X es una técnica consolidada y bien estudiada para proporcionar una representación tridimensional del aspecto de una molécula en un cristal. Los científicos han empleado la cristalografía de rayos X para determinar las estructuras cristalinas de muchas moléculas.

Para poder realizar un análisis cristalográfico mediante rayos X, se debe montar una muestra del cristal en un dispositivo de posicionamiento, a continuación, alinearla cuidadosamente de forma que la totalidad del cristal esté dentro del diámetro del haz de rayos X, y unos datos de difracción de rayos X recogidos en numerosos ángulos de rotación. Puesto que los tamaños típicos de los cristales y el diámetro del haz de rayos X están en el intervalo de 100 a 400 micrómetros, el alineamiento necesita un alto grado de precisión. Además, para garantizar la integridad de los cristales, los cristales deben almacenarse en nitrógeno líquido y mantenerse a temperaturas cercanas a las del nitrógeno líquido durante la totalidad de los procesos de montaje, alineamiento y adquisición de datos. En la actualidad, el montaje y el alineamiento de las muestras se llevan a cabo manualmente.

Un aparato típico de cristalografía de rayos X comprende un generador de rayos X, un detector y un husillo rotatorio sobre el que se monta un cabezal del dispositivo de posicionamiento de ajuste fino. Los datos de difracción brutos recogidos por el detector se introducen en un ordenador para su procesamiento. El cabezal del dispositivo de posicionamiento permite mínimos ajustes en dos ejes que son perpendiculares entre sí y con el eje del husillo. Algunos cabezales de dispositivos de posicionamientos también permiten ajustes angulares en uno de los ejes. Se proporciona un tercer eje de ajuste mediante la traslación del husillo giratorio en una dirección que es ortogonal a los dos ejes del cabezal del dispositivo de posicionamiento. La posición de montaje de la muestra del cabezal del dispositivo de posicionamiento se coloca de forma que, una vez montada, la muestra está casi en la línea central del

haz de rayos X. Una cámara CCD está montada de forma que se pueda mostrar en un monitor de video una imagen ampliada de la muestra. Una mira en el monitor de video indica la posición deseada de la muestra, que corresponde a la intersección del centro del haz de rayos X con el eje de husillo. Para mantener la muestra a una temperatura lo suficientemente baja una vez montada, se dirige una corriente de nitrógeno gaseoso frío a la posición de montaje de la muestra.

Se describe a continuación el procedimiento manual de montaje y alineamiento de la muestra. Un operario coloca la muestra dentro de un pequeño recipiente con nitrógeno líquido y después lleva el recipiente hasta la proximidad de la posición de montaje de la muestra en el cabezal del dispositivo de posicionamiento. Tan rápidamente como puede, el operario retira la muestra y la monta en el cabezal del dispositivo de posicionamiento. Mediante la imagen 45 de video del monitor, el operador gira los tornillos de ajuste que controlan los ejes “X’, “Y’, y ‘Z” hasta que la muestra está centrada dentro de los ejes del haz de rayos X y del husillo (como se indica mediante la mira del monitor de video) Una vez se ha centrado la muestra, comienza el análisis de la misma mediante rayos X. El procedimiento se ha descrito detalladamente en Garman, y col., “Macromolecular Cr y ocr y stallography”, J. AppI. Cr y st. (1997) 30, 211237 (a partir de ahora en el presente documento “Garman y col.”) , incorporado al presente documento por referencia.

De acuerdo con Garman, y col., existen numerosos problemas implicados en los procedimientos manuales para recoger datos de difracción de rayos X procedentes de cristales macromoleculares a temperaturas criogénicas. De acuerdo con Garman, los requisitos previos para iniciar la adquisición de datos criogénicos son un criostato fiable, la 55 capacidad de mantener un ambiente exento de hielo, cierto aparato para montaje del cristal, un número suficiente de cristales, y cierta destreza manual del operario para conseguir una operación rápida y suave. Una parte importante de una adquisición de datos criocristalográficos es el método de montaje del cristal y el hardware asociado con el mismo. Los cristales macromoleculares requieren un tratamiento especial en comparación con los cristales de pequeñas moléculas, debido a que los cristales macromoleculares tienen un contenido de líquido que oscila aproximadamente entre 5 y 70%. La técnica más utilizada en la actualidad es el método del bucle, que permite suspender un cristal por tensión superficial sobre una película fina de tampón crioprotegido. Los primeros bucles estaban fabricados en alambre de tungsteno chapado en oro. Estos bucles metálicos fueron sustituidos por bucles fabricados a partir de diferentes fibras finas (diámetro de 10-50 μm) que no absorben ni dispersan los rayos X en la misma medida que el metal, tal como cabello, fibra de vidrio, nylon, rayón, hilo de pescar, hilo dental sin 65 recubrimiento de cera, algodón, sutura quirúrgica y lana de mohair.

Existen varias formas de conectar el pasador que soporta el bucle al cabezal del dispositivo de posicionamiento. Dos procedimientos muy usados son la inserción del pasador directamente en un orificio del cabezal del dispositivo de posicionamiento y la unión de un imán al cabezal del dispositivo de posicionamiento, mediante el que se une y se sujeta firmemente un soporte del pasador.

La evaporación desde la película suspendida en el bucle es muy rápida debido a su elevada relación entre la superficie y el volumen. Así, uno de los parámetros más críticos en un experimento de criocristalografía es el tiempo que pasa entre la extracción del cristal y su refrigeración a chorro. Este tipo debe ser tan corto como sea posible, idealmente siendo inferior a un segundo, de lo contrario, el cristal se puede deshidratar, o los componentes del tampón pueden precipitar. De acuerdo con Garman y col., todas las manipulaciones y movimientos deben practicarse varias veces sobre seco, sin nada en el bucle, para asegurar después una operación suave y rápida. No se debe perder tiempo en observar el cristal dentro del bucle, ya que enfriar súbitamente un bucle vacío es menos perjudicial que perder los cristales antes del enfriamiento si uno se para a comprobar cuál es su posición exacta en el bucle.

Para la mayor parte de cristales de proteína, el enfriamiento súbito en una corriente de gas es perfectamente adecuado y representa la opción más segura y simple. Desde un punto de vista práctico, para un enfriamiento súbito en una corriente de gas es útil en primer lugar disponer de un segundo operario presente que pueda desviar la corriente de gas sujetando un trozo de cartón por encima tan pronto como se capturan las señales de “pesca” del cristal. Una vez el cristal se ha colocado, el cartón se retira rápidamente asegurando un enfriamiento rápido y reproducible. Los criocristalógrafos experimentados tienden a desviar la corriente de gas frío por si mismo o no desviarla en absoluto cuando colocan el cristal sobre el cabezal del dispositivo de posicionamiento, dependiendo el éxito de la rapidez y de la precisión de su acción.

La dificultad más habitual que tienen los experimentadores que empiezan a usar criotécnicas es el hielo que rodea, está próximo, por encima y/o dentro del cristal. Existen varios motivos para que se forme hielo alrededor del cristal. El extremo de la boquilla puede estar colocada demasiado lejos del cristal: idealmente, debería estar tan cerca como fuera posible porque el perfil de temperatura del nitrógeno frío es muy brusco (la temperatura aumenta desde 1000 K a temperatura ambiente a unos pocos milímetros para la mayoría de sistemas en flujo abierto) . Además, más lejos de la boquilla, la corriente de gas se disipa y por tanto es más susceptible a los efectos de la turbulencia y la corriente. Si se coloca la crioboquilla cerca del cristal, esto produce una sombre en el detector de rayos X, por lo que se debe pensar en cambiar el ángulo de enfoque de la corriente. Si esto resulta imposible, la sombra se puede enmascarar durante el procesamiento de los datos.

Una pregunta que surge con frecuencia se refiere al ángulo de incidencia... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para montar una muestra que comprende un cristal para llevar a cabo un análisis por difracción de rayos X, comprendiendo el procedimiento las etapas de: 5

(a) proporcionar un soporte del cristal (42) que contiene al menos un cristal;

(b) proporcionar una herramienta (72) capaz de recuperar dicho soporte del cristal (42) ;

(c) desplazar dicha herramienta mediante un robot (24) ;

(d) proporcionar un dispositivo de posicionamiento (12) para montar dicho soporte del cristal (42) de forma que dicho cristal esté en el camino de un haz de rayos X; y

(e) activar dicho robot (24) de forma que dicha herramienta recupere dicho soporte del cristal (42) , reciba una cantidad suficiente de un fluido para mantener dicho cristal en dicho soporte del cristal (42) a una temperatura que no supere aproximadamente 160º K, transferir dicho soporte del cristal (42) recuperado a dicho dispositivo de posicionamiento (12) , y montar dicho soporte del cristal (42) transferido a dicho dispositivo de

posicionamiento (12) , en el que dicho cristal en dicho soporte del cristal (42) recuperado se mantiene a una temperatura que no supere aproximadamente 160º K.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicho soporte del cristal (42) está montado en dicho dispositivo de posicionamiento (12) mediante roscas trefiladas.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho cristal en dicho soporte del cristal (42) recuperado está protegido del aire.

4. Un aparato capaz de llevar a cabo el procedimiento de la reivindicación 1 para montar una muestra que 25 comprende un cristal, comprendiendo dicho procedimiento: un carril (22) que incluye celdillas de almacenamiento

(44) para alojar una pluralidad de soportes de cristales (42) , un aparato para recuperar un soporte del cristal (42) de una celdilla de almacenamiento (44) , un dispositivo de posicionamiento (12) montado en un husillo (14) móvil, un robot (24) , un controlador (26) del robot y un ordenador (28) de automatización en comunicación con dicho controlador (26) del robot, caracterizado por que dicho robot (24) es un robot (24) mutieje y dicho aparato para recuperar un soporte del cristal (42) comprende una herramienta robotizada (72) que está activada por dicho robot

(24) y está adaptada para alojar una cantidad suficiente de un fluido para mantener un cristal en un soporte del cristal (42) recuperado a una temperatura que no supere aproximadamente 160.

5. El aparato de la reivindicación 4, caracterizado por que dicho soporte del cristal (42) comprende: 35

(a) una base (62) ;

(b) un elemento de conexión (66) desde dicha base (62) ;

(c) un vástago (74) que se proyecta desde dicho elemento de conexión (66) , soportando dicho vástago (74) un bucle (76) para alojar dicho cristal; y

(d) al menos una abertura (77) en dicho elemento de conexión (66) para permitir el venteo de dicho dispositivo, pudiéndose conectar dicho dispositivo tanto a una celdilla de almacenamiento (44) como a un dispositivo de posicionamiento (12) .

6. El aparato de la reivindicación 5, en el que dicha base (62) de dicho soporte del cristal (42) tiene forma cilíndrica y 45 comprende de forma preferible una muesca (60) para bloquear dicho dispositivo en dicho carril (22) .

7. El aparato de la reivindicación 5, en el que dicho elemento de conexión (66) de dicho soporte del cristal (42) tiene forma cilíndrica y está preferiblemente trefilado.

8. El aparato de la reivindicación 5, en el que dicho soporte del cristal (42) se puede atraer mediante un imán (120) .

9. El aparato de la reivindicación 4, caracterizado por que dicho aparato para recuperar un soporte del cristal (42) desde una celdilla de almacenamiento (44) comprende:

(a) un elemento giratorio capaz de recuperar el soporte del cristal (42) de la celdilla de almacenamiento (44) ;

(b) un medio para hacer girar un elemento giratorio en una dirección de rotación dada cuando el medio giratorio está en posición bloqueada;

(c) un medio para proporcionar una cantidad de par controlada cuando dicho medio giratorio se está deslizando en relación al elemento giratorio; y

(d) un medio para activar dicho medio giratorio y dicho medio controlador del par.

10. El aparato de la reivindicación 4, caracterizado por que dicho aparato para recuperar un soporte del cristal (42) de una celdilla de almacenamiento (44) , comprende:

(a) un embrague (94) que tiene un alojamiento cilíndrico (108) , comprendiendo dicho alojamiento (108) un orificio rodeado por una pared;

(b) un pistón cilíndrico (106) capaz de desplazarse axialmente dentro de dicho orificio de dicho alojamiento (108) ;

(c) teniendo dicho pistón (106) al menos una ranura (104) alargada en el perímetro exterior del mismo, pudiendo

dicha ranura (104) recibir un pasador de bloqueo (56) ; 5 (d) teniendo dicho alojamiento (108) al menos una abertura que se extiende a través de la pared del mismo;

(e) al menos un pasador de resorte (102) retenido en dicha abertura, siendo capaz dicho pasador (102) de engranar dicha ranura (104) alargada cuando dicho pistón (106) está colocado en una primera posición de dicho alojamiento (108) , siendo capaz dicho pasador (102) de desengranar dicha ranura (104) alargada cuando dicho pistón (106) está colocado en una segunda posición de dicho alojamiento (108) ;

(f) un medio en dicho alojamiento (108) para desviar de forma elástica el pistón (106) hacia la primera posición de dicho alojamiento (108) ;

(g) una arandela (114) circular en contacto con dicha pared interior de dicho alojamiento (108) , proporcionando fricción entre una pestaña de salida (100) y una placa de fricción (110) ; y

(h) un eje unido a dicho pistón, siendo dicho eje capaz de transmitir par a la placa de fricción (110) , siendo dicho eje capaz adicionalmente de desplazarse axialmente con respecto a la placa de fricción (110) .

11. El aparato de la reivindicación 10, que incluye además medios para proporcionar cumplimiento axial de dicha pestaña de salida (100) con respecto a dicha pestaña de entrada (98) . 20

12. El aparato de la reivindicación 4, caracterizado por que cada una de dichas celdillas de almacenamiento (44) de dicho carril (22) para alojar los soportes del cristal (42) comprende una base (46) y una abertura, siendo el área de dicha abertura más grande que el área de dicha base (46) , circunscribiendo al menos una pared lateral dicha base (46) y dicha abertura, teniendo dicha base (46) área suficiente para dejar sitio a un soporte del cristal (42) ,

teniendo dicha abertura área suficiente para permitir la introducción de una herramienta para recuperar el portamuestras de cristal; teniendo dicha base (46) unida a la misma un medio para bloquear dicho soporte del cristal

(42) a dicho carril (22) .

13. El aparato de la reivindicación 12, caracterizado por que dicho medio para bloquear dicho soporte del cristal 30 (42) en dicho carril (22) es un pasador de bloqueo (56) .

14. El aparato de la reivindicación 4, caracterizado por que dicho aparato para recuperar un soporte del cristal (42) de una celdilla de almacenamiento (44) hasta un dispositivo de posicionamiento (12) , comprende un elemento alargado que tiene un primer extremo y un segundo extremo, siendo capaz dicho primer extremo de estar unido a un robot (24) , siendo capaz dicho extremo de estar acoplado a dicho soporte del cristal (42) , siendo capaz dicho dispositivo de mantener un cristal en dicho soporte del cristal (42) a una temperatura no superior a aproximadamente 160 K cuando dicho segundo extremo está acoplado a dicho soporte del cristal (42) .

15. El aparato de la reivindicación 4, caracterizado por que dicho aparato para recuperar un soporte del cristal (42)

de una celdilla de almacenamiento (44) hasta un dispositivo de posicionamiento (12) , comprende un elemento alargado que tiene un primer extremo y un segundo extremo, siendo capaz dicho primer extremo de estar unido a un robot (24) , siendo capaz dicho extremo de estar acoplado a dicho soporte del cristal (42) , siendo capaz dicho dispositivo de apantallar dicho soporte del cristal (42) del aire ambiental cuando dicho segundo extremo está acoplado a dicho soporte del cristal (42) .

16. El aparato de la reivindicación 14 o 15, que incluye además un venteo (80) para dejar que el aire se escape de dicho dispositivo.