Macroperlas que contienen células secretoras que comprenden agarosa Seakem Gold, y sus usos.

Un método para producir una perla de agarosa que contiene células secretoras,

revestida con agarosa, que comprende:

(a) suspender células secretoras en una primera agarosa, en el que dicha primera agarosa tiene un contenido de sulfato menor que 0,2% en peso pero mayor que cero, un contenido de piruvato de 0-0,1% en peso, un contenido de nitrógeno de 0-0,2% en peso, y forma un gel que tiene una resistencia de gel a una concentración de 1,0% en peso de al menos 1200 g/cm2, ausencia sustancial de unión a ADN en tampón de tris-acetato 0,7M o menos, y una electroendosmosis a una concentración de 1,0% en peso de 0,05 o menos,

(b) formar una perla a partir de dichas células secretoras suspendidas de la etapa (a),

(c) incubar dicha perla de la etapa (b) en aire humidificado, y

(d) revestir dicha perla de la etapa (c) con una segunda agarosa, para formar una perla de agarosa que contiene células secretoras, revestida con agarosa.

Macroperlas que contienen células secretoras que comprenden agarosa Seakem Gold, y sus usos SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad de las solicitudes provisionales Serie nº 60/629.227, presentada el 17 de noviembre de 2004, y Serie nº 60/720.917, presentada el 26 de septiembre de 2005.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a métodos para mejorar la calidad y cantidad de macroperlas de agarosa que contienen células secretoras revestidas con agarosa. Esto se logra vía el uso de agarosa Seakem Gold descrita más abajo.

ANTECEDENTES Y TÉCNICA ANTERIOR

Ahora se ha confirmado que la terapia de sustitución de islotes es un enfoque viable para el tratamiento de pacientes con diversos trastornos. Estos incluyen pacientes con cáncer que sufren evisceración abdominal superior (Tzakis, et al., Lancet 336: 402-405 (1990) ) ; pancreatitis (Clayton, et al., Transplantation 76: 92-98 (2003) ; Farney, et al., Surger y 110: 427-437 (1991) ; Fontes, et al., Transplant Proc 24: 2809 (1992) ; Obenholzer, et al., Transplantation 69: 1115-1123 (2000) ; Robertson, et al., Diabetes 50: 47-50 (2001) ) , y pacientes insulinodependientes, en los que el transplante de islotes es una opción terapéutica (Goss, et al., Transplantation 74: 1761-1766 (2002) ; Ricordi, et al., Transplantation 75: 1524-1527 (2003) ; Ryan, et al., Diabetes 50: 710-719 (2001) ; Shapiro, et al., N. Engl. J. Med 343: 230-238 (2000) ) .

Debido a la utilidad de los islotes en terapia, como se indica más arriba, hay por supuesto interés a la hora de desarrollar formas para aislarlos. Aunque hay muchos informes sobre el aislamiento de islotes usando el método automatizado (Brandhorst, et al., Exp. Clin. Endocrinol Diabetes 103 Supl. 2: 3-14 (1995) ; Cui, et al., Cell Transplant

6: 48-54 (2001) ; Marchetti, et al., Transplantation 52: 209-213 (1991) ; Miyamoto, et al., Cell Transplant 7: 397-402 (1998) ; Nielsen, et al., Comp. Med. 52: 127-135 (2002) ; Swanson, et al., Hum. Immunnol 62: 73 9-749 (2001) ; Toomey, et al., Brit. J. Surg. 80: 240-243 (1993) ; Toso, et al., Cell Transplant 9: 297-305 (2000) ; Wennberg, et al., Transplant. Proc. 33: 2537 (2001) ) , el aislamiento de islotes sigue siendo notoriamente difícil. Por ejemplo, Bosta, et al., J. Investig Med 43: 555-566 (1995) ; Krickhahn, et al., Cell Transplant 11: 827-838 (2002) ; Krickhahn, et al., Ann Transplant 6: 48-54 (2001) , O'Neil, et al., Cell Transplant 10: 235-246 (2001) , y White, et al., Horm. Metab. Res 31: 579-524 (1999) , discuten problemas con respecto a esto.

La fabricación de microperlas que contienen células secretoras y/u orgánulos, tales como células cancerosas, islotes, etc., es bien conocida. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.818.230; 6.808.705; RE 38.027; 6.303.151; 6.224.912; 5.888.497, y 5.643.569, así como la solicitud de patente U.S. publicada 2005/0096561, todas las cuales se incorporan como referencia.

La agarosa se usa para encapsular los materiales biológicos en estos documentos de patente, después de lo cual las estructuras resultantes se encapsulan adicionalmente con una segunda capa de agarosa.

Aquellos familiarizados con la agarosa reconocerán que hay muchos tipos y variedades de este material disponibles. Seakem Gold, uno de tales tipos de agarosa, se describe en la patente U.S. nº 4.983.268, cuya descripción se incorpora como referencia.

Existe una necesidad continua de versiones mejoradas de los materiales descritos primeramente en las patentes y en la solicitud expuestas más arriba. Ahora se ha encontrado que la agarosa Seakem Gold da como resultado un producto que es inesperadamente superior a los productos de la técnica anterior.

Los detalles de la invención se exponen en la descripción que sigue:

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA

La Figura 1 da información sobre los niveles de glucosa diaria media para animales de ensayo y de control.

DESCRICIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES PREFERIDAS

EJEMPLO 1

Se aislaron islotes según la metodología expuesta en Gazda, et al., publicada en la Solicitud de Patente 2006/0121445, publicada el 8 de junio de 2006, Serie Número 11/273.737, que se incorpora como referencia en su totalidad. Sin embargo, se debería de mantener en mente que son posibles y se pueden usar otras metodologías para aislar islotes, ya que la invención no depende del método de aislamiento particular.

Tras el aislamiento y evaluación, los páncreas adecuados se procesaron posteriormente. Se eliminó la grasa y el

tejido conectivo de las glándulas, y después el conducto pancreático principal se canuló con una aguja de extremo romo de 16 g, de acero inoxidable. Se perfusionó una disolución de HBSS que contiene colagenasa P, a una concentración de 1, 5-2, 0 g/l, a una velocidad de 50 ml/mm, a 30º C, para proporcionar 2 ml de disolución por gramo del peso del páncreas.

El páncreas se cubrió entonces con 500 ml de HBSS y PS al 2%, junto con 200 ml de disolución de colagenasa, a 30º C. La circulación externa de agua a 39º C calentó lentamente el órgano hasta 37º C, y mantuvo la temperatura del digestato a 36-37º C. Cuando los órganos parecieron disociados, y ofrecieron poca resistencia a la presión manual (después de un tiempo total de alrededor de 10-20 minutos, y 5-10 minutos después de alcanzar 37º C) , se detuvo la digestión.

El digestato recogido se centrifugó entonces, los sobrenadantes se aspiraron, y el pelete resultante se suspendió en PS al 10% y una disolución conservante de órganos. Los islotes se purificaron entonces en Ficoll discontinuo, con gradientes de densidad de 1, 105, 1, 095, 1, 085 y 1, 05 g/cm3, HBSS más PS al 2%, en tubos de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 650 g a 4º C y se recogieron las capas que contenían islotes, y se lavaron tres veces en HBSS más PS al 10%, después de lo cual se purificaron a mano del tejido sin islotes con la ayuda de un microscopio de disección. Los islotes se suspendieron de nuevo, y se usaron dos muestras de 0, 5 ml para contar el rendimiento de los islotes.

El rendimiento medio de diez páncreas ensayados fue 130.000 NIE (número de islotes equivalentes) , con una media de 1.101 NIE por gramo de tejido digerido. La pureza, en todos los casos, fue alrededor de 90%. Para 9 de los órganos, la viabilidad de los islotes fue mayor que 89%.

EJEMPLO 2

Después de aislamiento de los islotes, se determinaron varios parámetros, incluyendo la pureza y la viabilidad, como se menciona más arriba.

La pureza se evaluó tiñendo alrededor de 500 NIE con DTZ, durante diez minutos, y luego se llevó a cabo un análisis de imágenes estándar usando un microscopio de disección y una cámara digital.

La viabilidad se determinó tiñendo una muestra con diacetato de fluoresceína (FDA) y bromuro de etidio (EB) . Para la elaboración, se añadieron alrededor de 500 NIE a 1 ml de RPMI, PS al 10%, y antibiótico/antimitótico ("A/A") al 1%. Entonces, se añadieron 20 !l de la tinción de FDA, que se había preparado con 10 mg de FDA y 1 ml de acetona, y 200 !l de EB, que se había preparado con 30 !l de EB y 1 ml de PBS. Los islotes se tiñeron, en la oscuridad, durante siete minutos, y luego se visualizaron y se fotografiaron muestras aleatorias de 10-50 islotes con un microscopio fluorescente, para determinar la viabilidad usando un análisis de imágenes estándar.

También se midió el contenido de insulina de los islotes, colocando aproximadamente 500 NIE en disolución de extracción alcohólica ácida (7, 2 ml de HCl 1N, 400 ml de etanol desnaturalizado al 100%) . Las muestras se almacenaron a -20º C, y se llevó a cabo un RIA de insulina.

Tabla 1 5

EJEMPLO 3

Éste, y los ejemplos que siguen, abordan la pregunta de si se pueden usar en macroperlas los islotes identificados como útiles y aislados como se describe.

Los islotes purificados se suspendieron de nuevo en RPMI1640 + PS al 10% + A/A al 1%, en un volumen de 2000 NIE/ml. Los islotes se distribuyeron uniformemente en tubos, de modo que cada tubo contuviera 1 ml de la suspensión a 2000 NIE.

Después de sedimentar por gravedad, los sobrenadantes... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una perla de agarosa que contiene células secretoras, revestida con agarosa, que comprende:

(a) suspender células secretoras en una primera agarosa, en el que dicha primera agarosa tiene un contenido de sulfato menor que 0, 2% en peso pero mayor que cero, un contenido de piruvato de 0-0, 1% en peso, un contenido de nitrógeno de 0-0, 2% en peso, y forma un gel que tiene una resistencia de gel a una concentración de 1, 0% en peso de al menos 1200 g/cm2, ausencia sustancial de unión a ADN en tampón de tris-acetato 0, 7M o menos, y una electroendosmosis a una concentración de 1, 0% en peso de 0, 05 o menos,

(b) formar una perla a partir de dichas células secretoras suspendidas de la etapa (a) ,

(c) incubar dicha perla de la etapa (b) en aire humidificado, y

(d) revestir dicha perla de la etapa (c) con una segunda agarosa, para formar una perla de agarosa que contiene células secretoras, revestida con agarosa.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además hacer girar dicha perla de la etapa (c) en agarosa al 5%, poner en contacto con aceite mineral dicha perla que se hizo girar, y lavar dicha perla que se hizo girar para formar dicha perla de agarosa que contiene células secretoras, revestida con agarosa.

3. El método de la reivindicación 1, en el que las células secretoras son islotes.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dichos islotes son islotes seleccionados de un grupo que consiste en islotes humanos, islotes bovinos e islotes porcinos.

5. El método de la reivindicación 3, en el que dicha perla contiene de alrededor de 50 a alrededor de 5000 islotes, preferiblemente de alrededor de 100 a alrededor de 2500 islotes, lo más preferible alrededor de 475 a alrededor de 550 islotes.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicha perla es una macroperla con un diámetro de alrededor de 4 mm a alrededor de 12 mm, preferiblemente de alrededor de 4 mm a alrededor de 10 mm, más preferiblemente de alrededor de 4 mm a alrededor de 8 mm, lo más preferible de alrededor de 6 mm a alrededor de 8 mm.

7. El método de la reivindicación 1, que comprende revestir dicha perla con una capa de agarosa de alrededor de 0, 05 mm a alrededor de 5, 0 mm, preferiblemente de alrededor de 1, 00 mm a alrededor de 3, 0 mm, lo más preferible de alrededor de 1, 00 mm a alrededor de 2, 0 mm.

8. Una perla de agarosa que contiene células secretoras, revestida con agarosa, en la que la agarosa de la perla de agarosa que contiene células secretoras tiene un contenido de sulfato menor que 0, 2% en peso pero mayor que cero, un contenido de piruvato de 0-0, 1% en peso, un contenido de nitrógeno de 0-0, 2% en peso, y forma un gel que tiene una resistencia de gel a una concentración de 1, 0% en peso de al menos 1200 g/cm2, ausencia sustancial de unión a ADN en tampón de tris-acetato 0, 7M o menos, y una electroendosmosis a una concentración de 1, 0% en peso de 0, 05 o menos.

9. La perla de agarosa que contiene células secretoras revestida con agarosa de la reivindicación 8, en la que dicha perla contiene islotes.

10. La perla de agarosa que contiene células secretoras revestida de agarosa de la reivindicación 9, en la que dichos islotes son islotes seleccionados de un grupo que consiste en islotes humanos, islotes bovinos e islotes porcinos.

11. La perla de agarosa que contiene células secretoras revestida con agarosa de la reivindicación 9, que contiene de alrededor de 50 a alrededor de 5000 islotes, preferiblemente de alrededor de 100 a alrededor de 2500 islotes, lo más preferible de alrededor de 475 a alrededor de 550 islotes.

12. La perla de agarosa que contiene células secretoras revestida con agarosa de la reivindicación 9, que tiene un diámetro de alrededor de 4 mm a alrededor de 12 mm, preferiblemente de alrededor de 4 mm a alrededor de 10 mm, más preferiblemente de alrededor de 4 mm a alrededor de 8 mm, lo más preferible de alrededor de 6 mm a alrededor de 8 mm.

13. La perla de agarosa que contiene células secretoras revestida con agarosa de la reivindicación 8, en la que dicha perla está revestida con una capa de agarosa de alrededor de 0, 05 mm a alrededor de 5, 0 mm, preferiblemente de alrededor de 1, 00 mm a alrededor de 3, 0 mm, lo más preferible de alrededor de 1, 00 mm a

alrededor de 2, 0 mm.

14. Uso de las perlas de agarosa que contienen células secretoras revestidas con agarosa de la reivindicación 8, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una afección provocada por un funcionamiento alterado de las células secretoras.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que dicha afección es diabetes insulinodependiente.

16. Uso según la reivindicación 14, en el que dicha perla contiene islotes.

17. Uso según la reivindicación 16, en el que los islotes son islotes seleccionados de un grupo que consiste en islotes humanos, islotes porcinos e islotes bovinos.

18. Uso según la reivindicación 14, en el que dichas perlas son para la colocación en la cavidad intraperitoneal.