LACASA DE ALTO POTENCIAL REDOX.

Lacasa de alto potencial redox.

La presente invención describe la evolución dirigida de una lacasa de alto potencial redox expresada funcionalmente en S.

cerevisiae que presenta una alta tasa de producción, una elevada actividad y una gran termoestabilidad. La presente invención se refiere a la secuencia aminoacídica de dicha lacasa y a la secuencia nucleotídica que codifica para dicha lacasa. La lacasa de la invención presenta aplicaciones en diversos sectores: nano-biotecnología, industria papelera, biorremediación, industria textil, industria alimentaria, industria farmacéutica, industria química, etc.

Lacasa de alto potencial redox.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular, la tecnología del ADN recombinante yla biotecnología. Específicamente, se refiereauna enzimaoxidasadetipo lacasa mejoradaensuexpresión funcional, su actividad catalíticay su termoestabilidad.Laexpresión funcional, mejorade actividad catalíticaytermoestabilidad de la lacasa se lleva a cabo en células eucariotas de Saccharomyces cerevisiae a través de un proceso de evolución molecular dirigida. Dicha enzima pueden emplearse como catalizador en procesos industriales relacionados con la transformación de la biomasa lignocelulósica para la obtención de biocombustibles o la elaboración de productos de maderaypapelconnuevas propiedades, parael sector alimentario, la produccióntextilyel sector químico, asícomo parala biorremediacióndeefluentesycontaminantes ambientales, yparael diseñode bionanodispositivos.

Estado de la técnica anterior

Las lacasas (EC 1.10.3.2) son un grupo de oxidasas ampliamente distribuido en plantas superioresy en hongos, aunque también se han descrito en algunas bacterias e incluso en cutículas de insectos (Alcalde, 2007. Industrial enzymes. Structure, function and applications. Ed. Polaina, J.yMacCabe, A.P. Springer, Heidelberg (Alemania) , pp. 459-474) . Pertenecenalafamiliadelas oxidasas multicobreazul (juntoconlasascorbato oxidasayla ceruloplasmina) , yse presentan generalmente como glicoproteínas monoméricas extracelulares.

Las lacasas, individualmente, catalizan la oxidación de un amplio espectro de sustancias orgánicas aromáticas. Entre estas sustancias se encuentran los ortoypara-difenoles, los fenoles metoxi-substituidos, los bencenotioles, los hidroxindoles, el1-naftolyla siringaldazina (Gianfreda et al., 1999. Bioremediation Journal 3:1-25) . Los radicales libres resultantes sufren diferentes reacciones dependiendodesu estructuray delas condicionesde reacción.Elacoplamientode radicales libres generando productos diméricoso poliméricosylas descarboxilaciones oxidativas sonlasreaccionesmás frecuentes.Tambiénson sustratosde lacasaslos compuestos metálicosinorgánicos/orgánicos.ElMn2+ es oxidado a Mn3+ ytambién el Fe (EDTA) 2− es aceptado por la enzima (Thurston, 1994. Microbiology-UK 140:19-26) .

La oxidación de todos estos sustratos va acoplada a la reducción del oxígeno molecular a dos moléculas de agua. Esto significaqueporcada moléculade oxígeno reducida, se oxidan4moléculasde sustratosin producir peróxidode hidrógeno.Por estosmotivos, las lacasasse consideran comolos catalizadores“verdes” idealesyaque empleanO2 como co-sustrato generandoúnicamenteH2Ocomo subproducto.

Las lacasas contienenun cobredetipo1 (T1) donde tienelugarla oxidacióndel sustrato reductor, y un centroo cluster trinuclear con tres cobres, un T2ydos T3, donde tiene lugar la reducción delO2. El mecanismo de reacción debe funcionar como una batería, almacenando electrones de las reacciones de oxidación individuales para reducir el oxígeno molecular y produciragua (Davies, 2002. Lacease.En: Handbookof Metallproteins. (edA. Messercschimdt et al) , pp. 1359-1368. JohnWileyandSons, LTD, NewYork) .

El potencial redox formal (Eº’) de las lacasas tiene una relación directa con la energía requerida para arrancar un electrón al sustrato reductor, constituyendo una de las características fundamentales de estas enzimas. De hecho, el comportamiento catalítico de las lacasas sobre la mayoría de los sustratos reductores depende del Eº’ en el Cu T1 (aceptor de electrones) . De este modo, las lacasas con un mayor Eº’T1 son de especial interés en biotecnología debido a que son capaces de oxidar sustratos con mayor Eº’ como ciertos hidrocarburos aromáticos policíclicos o diversos colorantes orgánicos sintéticos. El Eº’ de diferentes lacasas ha sido ampliamente estudiado mediante técnicas espectroelectroquímicas (principalmente voltamperometría cíclicay valoraciones redox) haciendo usode diferentes tiposde electrodosymediadores redox (Xu, F. et al., 1998. Biochem. J. 334:63-70; Shleev, S.V. et al. 2004. Biochimie 86:693-703) .

ElEº’delCuT1dealgunas lacasasfúngicasesmayor (Eº’T1 cercanoa+800mV) queeldelas lacasasdeplantas

o bacterianas (por ejemplo la lacasa de Rhus vernicifera tiene un Eº’T1= +400 mV) yotras oxidasas multicobre azul (ascorbato oxidasa Eº’T1= +340 mV) . Sin embargo, es importante señalar que también existen marcadas diferencias en los Eº’T1 de las diferentes lacasas fúngicas, desde +465 mV de la lacasa del ascomiceto Myceliophtorathermophila hasta +790 mV de la lacasa del basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus. En este sentido, se ha realizado un enorme esfuerzoconla intenciónde dilucidarquéfactores determinanestas diferenciasenlosEº’T1, sobretodosisetienenen cuenta las geometrías de coordinación de los sitios de Cu, prácticamente conservadas. La mayor parte de estos estudios físico-químicos se ha servido del conocimiento aportado por los modelos cristalográficos disponibles. En concreto se han resueltoafechadehoylas estructurasen3Dde8lacasasde Coprinus cinereus, Melanocarpus albomyces, Bacillus subtilis, Trametes versicolor, Rigidoporus lignosus, Lentinus tigrinus, Trametes trogii yPycnoporus cinnabarinus.

Las llamadas “lacasas de alto potencial redox” -procedentes de hongos basidiomicetos de podredumbre blanca-poseen un enorme potencial biotecnológico debido a su amplia especificidad de sustrato (oxidan fenoles, aminas, tioles, antraceno, etc.) yasusbajos requerimientosde aplicación (sólorequieren oxígeno, quees transformadoenagua durantela reacción) .Cuandoactúansobreelpolímerodelignina (ocompuestosdetipofenólico) pueden catalizartanto actividades de degradación como de polimerización. Además, su rango de sustratos puede ser ampliado a compuestos no fenólicos más difíciles de degradar utilizando mediadores redox, de origen natural o sintético, en los denominados sistemas lacasa-mediador (Camarero et al., 2005. Appl. Environ. Microb. 71:1775-1784) .

La tecnología de las lacasas de alto potencial redox puede ser empleada en prácticamente la totalidad de la cadena de producción de productos papeleros: la elaboración de la pasta de papel, el blanqueo libre de cloro de las pastas, la eliminación del pitch o el tratamiento de efluentes.

Enla industriadeproductos forestalesdos áreas másdeinvestigación emergentes sona) el diseñode materiales lignocelulósicos con nuevas propiedades de resistencia y estabilidad mediante el injerto de compuestos fenólicos catalizado por lacasa, enla denominada “funcionalizaciónde las fibrasde celulosa”;yb) el usode lacasas parala mejora en la adhesión de tableros de madera (mediante el acoplamiento enzimático in situ de la lignina) , sin necesidad de utilizar adhesivos tóxicos a base de formaldehído. Además, las lacasas encuentran aplicaciones en los siguientes sectores (Xu, 2005. Industrial Biotechnology 1:38-50) :

i) La industria alimentaria: procesamiento de bebidas o de productos de panadería.

ii) La industria textil: degradación (detoxificación) de los colorantes de los efluentes o blanqueo de tejidos (lavado a la piedra de jeans) .

iii) Nanobiotecología: a) como detectores de fenoles, oxígeno, azidas, morfina, codeína, catecolaminas o flavonoides enla elaboraciónde biosensores para análisis clínicosy medioambientales;yb) elaboraciónde biopilas de combustible que ofrecen energía eléctrica limpia (sin utilizar combustibles fósiles) mediante la inmovilización de lacasas en elcátodo.

iv) Biorremediación: degradación dePAHs (Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos) , compuestosAOX (Halógenos Orgánicos Absorbibles) , etc.

v) Síntesis química: a) producción de polímeros complejos (ej. policatecol para resinas de cromatografía) ; b) síntesis de agentes farmacológicos: antitumorales (ej. viblastina) , nuevos derivados antibióticos (ej de la ciclosporina A) , o colorantes (Suberasa® de Novozymes) ; c) cosméticos: tintes de cabello formulados con lacasa.

La aplicacióndelas lacasasanivel industrial requierede sistemasdeexpresiónrobustosque proporcionen altos niveles de enzima activa. El empleo de sistemas de expresión heterólogos posibilita la producción de lacasas de diferentes procedencias en un mismo hospedador, así comode nuevasvariantes con propiedades mejoradas con respecto a la enzima salvaje.

Por este motivo, se ha... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótidoque codificaparael polipéptidode secuencia aminoacídicaSEQIDNO:1.

2. Polinucleótidosegúnlareivindicación1de secuencia nucleotídicaSEQIDNO:2.

3. Construcción genética que comprende:

a. el polinucleótido según cualquierade las reivindicaciones1ó2.

b. el polinucleótidosegún cualquieradelasreivindicaciones1ó2, que además comprendeun sistemaovector deexpresión génica, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirijala transcripciónde dicho polinucleótido, y/o con otras secuencias nucleotídicas necesarias o apropiadas para la transcripción in vitro o in vivo ysu regulación en tiempoylugar.

4. Construcción genética según la reivindicación 3, que además comprende un polinucleótido que codifica para un péptido señalquefavorecelaexpresión funcionaldel polipéptidode secuencia aminoacídicaSEQIDNO:1.

5. Construcción genética según la reivindicación 4, donde el péptido señal es el del factor α evolucionado de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9.

6. Construcción genética según cualquierade las reivindicaciones4ó5, dondeel polinucleótido que codifica para el péptido señal es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 10.

7. Construcción genéticasegún cualquieradelasreivindicaciones4-6, que comprendeunpolinucleótidoque codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3.

8. Construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que comprende el polinucleótido de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 4.

9. Construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones3-8, donde entre la secuencia nucleotídica que codifica para el péptido señal delfactor α yla secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídicaSEQIDNO:1, se encuentrala secuencia nucleotídicaque codificaparalos aminoácidosácidoglutámico yfenilalanina.

10. Construcción genética según la reivindicación9que comprende un polinucleótido que codifica para el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5.

11. Construcción genética según cualquierade las reivindicaciones9 o10 que comprendeel polinucleótidode secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 6.

12. Célula hospedadora que comprende un polinucleótido según cualquierade las reivindicaciones1ó2, o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 3-11.

13. Célula hospedadora según la reivindicación 12, que es una levadura.

14. Célula hospedadora según la reivindicación 13, que pertenece al género Saccharomyces.

15. Célula hospedadorasegún cualquieradelasreivindicaciones13ó14que perteneceala especie Saccharomyces cerevisiae.

16. Lacasa de alto potencial redox que comprende el polipéptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

17. Lacasa de alto potencial redox según la reivindicación 16 que además comprende los aminoácidos ácido glutámicoyfenilalaninaenelextremo aminodel polipéptido, cuya secuencia aminoacídicaesSEQIDNO:7.

18. Lacasa de alto potencial redox según cualquiera de las reivindicaciones16ó17, que además comprende los últimos cuatro aminoácidos del péptido señal delfactor α (ácido glutámico, treonina, ácido glutámico, alanina) en el extremo amino del polipéptido, cuya secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 8.

19. Método de obtención de una lacasa de alto potencial redox según se describe en las reivindicaciones 16-18, que comprende:

a. cultivarla célula hospedadora según cualquierade las reivindicaciones 12-15, y

b. purificar la lacasa.

20. Usode los polinucleótidos según cualquierade las reivindicaciones1ó2 ode las construcciones genéticas según cualquierade las reivindicaciones 3-11 parala obtenciónde una lacasade altopotencial redox.

21. Uso de la célula hospedadora según cualquiera delas reivindicaciones 12-15 para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.

22. Cultivo celular que comprende las células hospedadoras según cualquiera de las reivindicaciones 12-15.

23. Uso del cultivo según la reivindicación 22 para la obtención de una lacasa de alto potencial redox.