Procedimiento para la purificación de un complejo factor VIII/factor von Willebrans(vWF) por cromatografía de intercambio catiónico.

La invención se refiere a un procedimiento para obtener un complejo del factor VIII/vWF,

que se caracteriza en que el complejo del factor VIII/vWF de una solución de proteínas se une con un intercambiador de cationes y el complejo de factor VIII/vWF que contiene especialmente multímeros de vWF de alto peso molecular se obtiene mediante levigación gradual. La invención también se refiere a un complejo de factor VIII/vWF que puede obtenerse mediante cromatografía de intercambio de cationes.

Procedimiento para la purificación de un complejo factor VIII/ factor von willebrand (vWF) por cromatografía de intercambio catiónico La invención se refiere a un procedimiento para la purificación de un complejo factor VIII/vWF a partir de un material de partida biológico por cromatografía de intercambio catiónico (donde el intercambiador de cationes no es heparina) y elución gradual, así como a un complejo factor VIII/vWF purificado que, en particular, contiene multímeros de vWF de alto peso molecular.

En plasma, el factor von Willebrand circula en una concentración de 5 a 10 mg/l y, en su mayor parte, en forma de complejo con el factor VIII no ligado de modo covalente. En crioprecipitado, el complejo factor VIII/vWF está fuertemente enriquecido y puede aislarse del mismo o desde el plasma o desde fracciones de plasma mediante procedimientos de fraccionamiento conocidos.

En el caso de la hemofilia, la coagulación sanguínea se ve afectada por la falta de determinados factores plasmáticos de coagulación sanguínea. En el caso de la hemofilia A, la tendencia a la hemorragia se debe a una falta de factor VIII o de vWF (hemofilia fenotípica) . El tratamiento de la hemofilia A se realiza en primer lugar sustituyendo el factor de coagulación deficiente por concentrados de factores, por ejemplo mediante infusión de factor VIII o de complejo factor VIII/vWF.

Para la terapia de pacientes con hemofilia A, pero también del síndrome de von Willebrand, es deseable utilizar un factor VIII purificado formando un complejo con vWF (Berntorp, 1994, Haemostasis 24: 289-297) . En particular, siempre se destaca que en aquellos preparados sin o con un pequeño contenido en vWF se puede observar un mayor tiempo de hemorragia y un corto período de semidesintegración del factor VIII:C in vivo. La normalización del vWF in vivo es importante para mantener la concentración de factor VIII plasmática, tanto por reducción del porcentaje de eliminación de factor VIII como también por el refuerzo de la liberación de factor VIII endógeno (Lethagen y col., 1992, Ann. Hematol. 65: 253-259) .

La DE 3 504 385 describe la realización de una cromatografía de intercambio iónico para la purificación del complejo factor VIII/vWF en la que se liga el complejo de factor VIII sobre grupos sulfato y se eluye con un tampón citrato, cloruro cálcico y un gradiente de NaCl. Aquí se eluye del vehículo el complejo factor VIII/vWF a una concentración 0, 5M de NaCl.

La EP 0 416 983 describe la obtención del complejo factor VIII/vWF a partir de plasma humano mediante la combinación de un precipitado de cloruro de bario o de hidróxido de aluminio y una cromatografía de intercambio aniónico en fractogel DEAE.

Harrison y col. (Thrombosis Res., 1988, 50, 295-304) describe la purificación del complejo factor VIII/vWF mediante cromatografía en sefarosa-sulfato-dextrano.

La EP 0 600 480 describe un procedimiento para la purificación de complejo factor VIII/vWF a partir de plasma total por medio de una cromatografía combinada de intercambio aniónico/intercambio catiónico. Entonces se lleva a cabo la elución del complejo FVIII/vWF adsorbido en el intercambiador de cationes se realiza utilizando una sustancia tampón que contiene Ca con 0, 3M NaCl, en un rango de pH entre 6, 6 y 7, 0.

La WO 96/10584 describe un procedimiento para la obtención de vWF recombinante altamente purificado por medio de una cromatografía de afinidad combinada de intercambio aniónico/heparina y la EP 0 705 846 describe la separación en fracciones tanto de alto peso molecular como de bajo peso molecular de vWF recombinante mediante cromatografía de afinidad/heparina.

Aunque los preparados de factor VIII descritos en el estado de la técnica actual contienen en su mayor parte todo el patrón multimérico de vWF, éste varía, sin embargo, entre la parte de vWF de alto peso molecular (HMW-vWF) y vWF de bajo peso molecular (LMW-vWF) y los preparados tienen las estructuras denominadas de triplete, que indican una descomposición proteolítica, en particular de HMW-vWF. Por ello, con frecuencia se ve limitada la estabilidad de estos preparados.

Continuamente se destaca que los preparados de factor VIII/vWF que contienen esencialmente HMW-vWF posiblemente favorecen positivamente la duración de la hemorragia, ya que realizan la función primaria del vWF, la aglutinación de plaquetas, y tienen una mayor afinidad con los receptores plaquetarios de glicoproteína IB y IIb/IIIa que los multímeros vWF de bajo peso molecular.

Existe la necesidad de un complejo de factor VIII con una actividad específica suficiente de factor VIII:C- y de vWF. El problema que surge durante la obtención de un complejo tal consiste particularmente en la separación de aquellas moléculas que contienen multímeros de vWF de bajo peso molecular y en el enriquecimiento de complejos con una alta actividad específica de vWF.

Por tanto, el objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un complejo factor VIII/vWF con una actividad específica y una estabilidad mejoradas.

Otro objetivo consiste en proporcionar un procedimiento para la obtención de tal complejo factor VIII/vWF. El procedimiento debería poder utilizarse para la purificación de complejos de factor VIII/vWF tanto recombinantes como también plasmáticos.

Según la invención este objetivo se alcanza en base a que se proporciona un procedimiento para la obtención de un complejo factor VIII/vWF en el que se liga el complejo factor VIII/vWF procedente de una solución proteica en un intercambiador de cationes -donde el intercambiador de cationes no es heparina -y, mediante una elución gradual fraccionada, se obtiene un complejo factor VIII/vWF con una mejor actividad específica de vWF. En particular, la obtención y el enriquecimiento del factor VIII/vWF con una mejor actividad y estabilidad se lleva a cabo debido a que se liga el complejo factor VIII/vWF con una concentración baja de sal , mediante un aumento gradual de la concentración de sal se separan, con una mayor concentración de sal, fracciones que contienen el complejo factor VIII/vWF con multímeros de vWF de bajo peso molecular, con una concentración media de sal productos inactivos de la descomposición del vWF y proteínas accidentales no específicas y se obtienen fracciones que contienen el complejo factor VIII/vWF conteniendo especialmente multímeros de vWF de alto peso molecular con una concentración de sal alta.

Normalmente, el complejo factor VIII/vWF se purifica gracias a su punto isoeléctrico ácido (IEP = 5, 5 a 6) y a la carga neta negativa resultante en un medio desde ligeramente ácido hasta básico sobre el intercambiador aniónico cargado positivamente. Por tanto, no podía esperarse, debido a los procedimientos hasta ahora descritos para la purificación del complejo factor VIII/vWF por el intercambiador aniónico de carga positiva, que el complejo factor VIII/vWF también se uniera a una matriz de gel cargada negativamente de un intercambiador catiónico a un pH por encima del IEP del complejo y con una concentración de sal baja y que pudiera efectuarse una elución selectiva de la misma mediante el aumento de la concentración de sal. Tampoco podía esperarse que por elución gradual con una concentración de sal de entre ≥ 250 mM y ≤ 300 mM, proteínas accidentales no específicas se pudieran eluir productos inactivos de descomposición de vWF, componentes del complejo con una reducida actividad específica, multímeros de vWF de bajo peso molecular que contienen el complejo factor VIII/vWF, factor VIII sin formar complejo de bajo peso molecular o factor VIII débilmente ligado y factor VIII libre y que a una concentración de sal ≥ 350 mM se obtuviera, especialmente, un complejo factor VIII/vWF con multímeros de vWF de alto peso molecular.

Dentro del marco de la presente invención, se observa que con el procedimiento según la invención, partiendo de un material biológico impuro se obtienen fracciones purificadas esencialmente libres de ácidos nucleicos contaminantes. Así, mediante este procedimiento se eliminan ácidos nucleicos de los preparados proteicos. Este efecto no es posible con los procedimientos tradicionales de intercambio aniónico, debido a que los ácidos nucleicos se ligan al intercambiador de aniones por su carga negativa, se desprenden de nuevo del intercambiador aniónico debido al aumento de la concentración de la sal y entran en el producto de elución.

Durante la purificación del complejo factor VIII/vWF hay que tener en cuenta, particularmente,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la obtención de un complejo factor VIII/vWF caracterizado porque se obtiene el complejo factor VIII/vWF a partir de una solución proteica ligado a un intercambiador de cationes y, por el aumento gradual de la concentración de sal, un complejo de factor VIII/vWF que contiene en particular multímeros vWF de alto peso molecular, no siendo el intercambiador de cationes heparina.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo factor VIII/vWF queda ligado en un intercambiador de cationes con una concentración de sal desde 50mM a 250mM, y se eluye y obtiene el complejo factor VIII/vWF con multímeros vWF de bajo peso molecular y factor VIII:C libre de actividad vWF de aglutinante plaquetario con una concentración de sal entre ≥ 250 mM y ≤ 300 mM.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el complejo factor VIII/vWF, que contiene en particular multímeros de vWF de alto peso molecular, se obtiene por fraccionamiento gradual con una concentración de sal de ≥ 350 mM.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque se obtiene una fracción que contiene un complejo factor VIII/vWF, fracción que está especialmente libre de multímeros de vWF de bajo peso molecular, de productos de descomposición de vWF, de factor VIII sin formar complejo o débilmente ligado con vWF y de ácidos nucleicos contaminantes.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la elución de los polipéptidos del intercambiador de cationes se realiza en un sistema tampón a un pH en el rango entre 4, 5 y 8, 5,

preferentemente ≥ 7, 1 y ≤ 8, 5.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el intercambiador de cationes es un vehículo conjugado con grupos sulfopropilo o carboximetilo.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se obtiene un complejo factor VIII/vWF que contiene, en particular, multímeros de vWF de alto peso molecular.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque el complejo factor VIII/vWF se obtiene a partir de plasma, de una fracción de plasma, de un crioprecipitado, de un sobrenadante libre de células o del extracto de un cultivo celular recombinante o de una fracción proteica enriquecida.

9. Complejo factor VIII/vWF que contiene especialmente multímeros de vWF de alto peso molecular que se obtiene a partir de una solución que contiene factor VIII/vWF mediante cromatografía de intercambio catiónico de acuerdo con un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, teniendo el complejo una actividad específica de vWF mínima de 66 U/mg de proteína y una actividad específica de factor VIII mínima de 500 U/mg de proteína.

10. Complejo factor VIII/vWF según la reivindicación 9, caracterizado porque está especialmente libre de multímeros de vWF de bajo peso molecular, de productos inactivos de descomposición de vWF, de factor VIII sin formar complejo y de actividad de factor VIIIa.

11. Preparado que contiene el complejo factor VIII/vWF según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque está garantizado contra virus y está libre de sustancias infecciosas.

12. Preparado según la reivindicación 11, caracterizado porque se presenta en una forma estable al almacenamiento.

13. Preparado según una de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque se formula como un preparado farmacéutico.

14. Utilización de un preparado según una de las reivindicaciones 11 a 13 para la producción de un medicamento para el tratamiento de pacientes con hemofilia A, hemofilia fenotípica y vWD.