Procedimiento para la producción y la aplicación de cultivos de protozoos.

Cultivo clonal de protozoos que comprende células protozoarias de una única especie de protozoo,

seleccionándose la especie de protozoo del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp., caracterizado porque el cultivo contiene bacterias simbióticas o su lisado.

Procedimiento para la producción y la aplicación de cultivos de protozoos La invención se refiere a la producción y la aplicación de cultivos de protozoo de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp.

La enfermedad de la cabeza negra, tiflohepatitis o histomoniasis en pavos se describió por primera vez por Smith (1895) . Pudieron obtenerse conocimientos esenciales para la etiología mediante los ensayos de Tyzzer (1920) . En este trabajo se describen por primera vez flagelos y pseudópodos, como criterio principal morfológico del agente patógeno, lo que clasificaba al agente patógeno como protozoo. La morfología del parásito y la existencia en pavos condujo a la denominación Histomonas meleagridis. El conocimiento de que el parásito pueda aparecer también en gallinas, condujo a la recomendación de mantener separadas estas especies animales. Como especies de aves sensibles adicionales se describen especialmente gallina de guinea, faisán, pavo real y codorniz, mientras que las aves acuáticas no cuentan como sensibles (McDougald, 2003) . Mediante la patogenia y la elevada prevalencia de la enfermedad en pavos esta especie ha de considerarse seguramente como uno de los huéspedes más sensibles.

En los dos últimos años se produjo en Europa una aparición intensificada de la enfermedad. Un motivo es especialmente la prohibición de agentes profilácticos y terapéuticos adecuados, con cuya ayuda se había combatido de forma controlada la enfermedad durante décadas. No obstante, el uso profiláctico de agentes terapéuticos en pavos, especialmente de nifursol, derivados de imidazol, tales como nitroimidazol y dimetridazol, como aditivos de alimentos para animales está prohibido en la Unión Europea (véase EEC1798/1995, EEC2205/2001 y EEC1756/2002) , dado que la inocuidad de estas sustancias (carcinogenicidad y genotoxicidad) no ha de descartarse para el consumidor. También Nitarsone usada en Norteamérica para la profilaxis (ácido 4-nitrofenilarsónico) no tiene autorización en Europa. Como consecuencia de este estado de necesidad absoluta de profilaxis y de terapia en distintos países de Europa, tras el brote de la enfermedad en poblaciones de pavos, en los dos últimos años debieron realizarse medidas de sacrificio (Hess y col., 2004) .

En el caso de las gallinas ponedoras la enfermedad transcurre más suavemente, pero mediante la cría alternativa creciente se produce también en este caso una aparición multiplicada (Hafez y col., 2001; Esquenet y col., 2003) .

Trabajos fundamentales sobre la propagación de Histomonas meleagridis en medios de cultivo celular se realizaron por Dwyer (1970) y más tarde por Stepkowski (1978) . Como base sirve a ambos autores material de heces o aislados de heces, que se propagan en condiciones agnotobióticos. Por consiguiente es posible una propagación del agente patógeno sólo en un medio correspondiente, lo que se determina principalmente mediante la flora acompañante.

En conjunto, los cultivos anteriores tienen la desventaja de que no son uniformes genéticamente, dado que consisten en varios agentes patógenos una y la misma especie. Además no está garantizado que se encuentren en el cultivo también otros protozoos, que son difíciles de diferenciar morfológicamente. La existencia de distintos protozoos en el intestino del ave de corral se describe con frecuencia (McDougald, 2003) , lo que subraya insistentemente esta problemática.

Como consecuencia de los cultivos poco caracterizados se usan resultados de experimentos in vitro e in vivo, en los que se usan tales cultivos, para valorar moderadamente. Las pruebas fiables de sustancias, tanto in vitro como in vivo, requieren un cultivo genéticamente uniforme, para impedir que determinados efectos se deban a la presencia de distintas subpoblaciones u otras especies de protozoo. Los resultados de ensayos en animales, que se realizaron en el pasado reciente, reflejan esta heterogeneidad (Hu y McDougald, 2003; Hu y col., 2004; Landmann, 2004) .

La heterogeneidad de cultivos requiere que determinadas subpoblaciones dominen de forma fenotípica, lo que proporciona falsas conclusiones sobre la sensibilidad general de un agente patógeno. Este problema se describe a modo de ejemplo para el agente patógeno de la malaria, Plasmodium falciparum (Rosario, 1981; Trager y col., 1981; Burkot y col., 1984; LeBras y col., 1983) . Como consecuencia de ello existe el riesgo de que en el contexto de las pruebas in vitro tiene lugar únicamente una selección y propagación de cepas resistentes, lo que no permite ninguna conclusión sobre la sensibilidad de un agente patógeno. Indicaciones sobre posibles subpoblaciones diferentes de Histomonas meleagridis existen a partir del trabajo de Gerbod y col. (2001) . Los autores han secuenciado a partir de 4 aislados partes del ARN ribosómico, esta sección genética se usa con frecuencia para análisis filogenéticos, y han determinado una ligera heterogeneidad en algunas posiciones. Los autores concluyen a partir de esto que esto podría ser una indicación para subpoblaciones diferentes. Indicaciones seguras sobre subpoblaciones dentro de las tres especies de protozoo mencionadas anteriormente existen de Tetratrichomonas gallinarum, tal como se notifica por Cepicka y col. (2005) . También de Blastocystis sp. está documentada con todo detalle la diversidad genética, también en cuanto a una posible problemática de zoonosis (Noel y col., 2003; Noel y col., 2003) .

En Kulda y col. (1974) se realizaron experimentos de infección con Tetratrichomonas gallinarum y a este respecto con un aislado se desencadenó la enfermedad de la cabeza negra típica para Histomonas meleagridis. Se mostró que este cultivo de infección de Tetratrichomonas gallinarum estaba contaminado con Histomonas meleagridis, basándose en el ensayo de heces microscópico.

En Goedbloed y Bool (1962) se infectaron pavos tanto con un cultivo de Histomonas meleagridis como Tetratrichomonas gallinarum y a continuación se realizaron ensayos histológicos. Tras una infección mixta se detectaron ambos agentes patógenos microscópicamente en las heces. Esto muestra el riesgo de que con el reaislamiento de cultivos de protozoo se aíslen varios cultivos, dado que no se conoce un medio selectivo.

Bayon y Bishop (1937) describen el aislamiento de Histomonas meleagridis a partir del hígado de una gallina, que se usó para el diagnóstico. De las heces del animal se aisló una mezcla de Blastocystis, Trichomonas y Chilomastix, pero ninguna histomona. Asimismo esto muestra claramente que en el caso de cultivos de protozoo se trata en la mayoría de los casos de coinfección o coaislamiento.

Bishop (1938) describe también el aislamiento de Trichomonas, Chilomastix y Blastocystis del intestino ciego de una gallina.

En Norton y col. (1999) se describe la presencia de Histomonas meleagridis y Tetratrichomonas gallinarum tras infección con el nematodo Ascaridia dissimilis.

Esto muestra que hasta la fecha no se conocían cultivos clonales de protozoos y asimismo no podían estar disponibles.

En el documento EP 600 396 A2 se dan a conocer procedimientos y agentes para la prevención o para el tratamiento de infecciones intestinales por protozoos, especialmente de Giardia lamblia. A este respecto se cultiva y separan en primer lugar cepas de Gardia lamblia de diferente origen, destruyéndose los protones obtenidos por medio de ultrasonidos, para obtener una vacuna correspondiente tras concentración y tratamiento adicionales.

En el documento GB 902 760 se describen procedimientos para la producción de endoparásitos atenuados, en los que se usa radiación ultravioleta para atenuar los mismos.

El documento FR 2 853 550 se refiere a un aditivo alimentario para la administración a animales, que comprende ácido cinámico, aldehído y tiosulfato. A este respecto se muestra que una mezcla que contiene estas sustancias puede combatir de manera eficaz protozoos tales como Fetratrichomonas gallinarum e Histomonas meleagridis.

Tan Kevin y col. (Experimental Parasitology 96 (1) (2000) : 9-15) se refiere al cultivo de cultivos de Blastocystis hominis sobre agar sólido.

El documento US 5 824 537 se refiere, entre otras cosas, a un procedimiento para la clonación in vitro de parásitos del género Babesia, obteniéndose células de parásitos individuales a partir de una suspensión de eritrocitos infectados, pudiendo usarse estas células individuales finalmente para la producción de un cultivo.

Clark y col. (Clinical Microbiology... [Seguir leyendo]

1. Cultivo clonal de protozoos que comprende células protozoarias de una única especie de protozoo, seleccionándose la especie de protozoo del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp., caracterizado porque el cultivo contiene bacterias simbióticas o su lisado.

2. Cultivo de protozoos según la reivindicación 1, caracterizado porque las bacterias son enterobacterias, especialmente bacterias coliformes, estafilococos, estreptotocos o mezclas de los mismos.

3. Formulación de vacuna que comprende células protozoarias clonales vivas o inactivadas de una única especie de protozoo seleccionada del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp. o un anticuerpo dirigido contra células protozoarias clonales de una única especie de protozoo seleccionada del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp.

4. Formulación de vacuna según la reivindicación 3, caracterizada porque la vacuna comprende un adyuvante, que se selecciona preferentemente del grupo constituido por adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, hidróxido de aluminio, Bordetella pertussis, saponina, muramil dipéptido, copolímero de etileno-acetato de vinilo, aceite, preferentemente un aceite vegetal o un aceite mineral, especialmente aceite de cacahuete o aceite de silicona, y combinaciones de los mismos.

5. Formulación de vacuna según la reivindicación 3 ó 4, caracterizada porque las células protozoarias clonales están inactivadas mediante pase, mediante radiación, especialmente mediante radiación UV y radioactiva, mediante sustancias químicas o mediante virus o mediante calor, formalina, beta-propiolactona o combinaciones de los mismos.

6. Formulación de vacuna según una de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizada porque la vacuna está adaptada para la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral o intracloacal.

7. Procedimiento para la producción de un cultivo clonal de protozoos que comprende células protozoarias de una única especie de protozoo seleccionada del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp. que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de partida que comprende células protozoarias de al menos una especie de protozoo seleccionada del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp., b) cultivar las células de la muestra de partida en un medio de cultivo que comprende una fuente de hidratos de carbono y bacterias de al menos una especie de bacteria, que viven in situ de forma simbiótica con las células protozoarias, o lisados de las mismas, c) individualizar las células protozoarias por medio de micromanipulación, d) cultivar las células protozoarias individualizadas en un medio de cultivo tal como se define en b) y e) eventualmente determinar la pureza del cultivo clonal de protozoos.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la muestra de partida es una muestra de heces, de tejido, de cultivo o del entorno.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la muestra de partida se proporciona por un ave de corral seleccionada del grupo constituido por pavo, gallina, faisán, pavo real, codorniz y gallina de guinea.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la fuente de hidratos de carbono es almidón, especialmente almidón de arroz, de maíz o de patata.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque las bacterias son enterobacterias, especialmente bacterias coliformes, estafilococos, estreptotocos o mezclas de los mismos.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizado porque el medio de cultivo contiene además sales, especialmente sales de Earle, aminoácidos, especialmente L-glutamina, y antibióticos/antimicóticos, especialmente penicilina, estreptomicina y anfotericina.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizado porque la pureza del cultivo se determina por medio de una técnica de amplificación de ácido nucleico o técnica de hibridación o por medio de una técnica inmunológica con anticuerpos dirigidos contra células protozoarias clonales de una única especie de protozoo seleccionada del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque se usan los oligonucleótidos 5'-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3' y 5'-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3' para la determinación de Histomonas meleagridis, 5'-GCAATTGTTTCTCCAGAAGTG-3' y 5'-GATGGCTCTCTTTGAGCTTG-3' para la determinación de Tetratrichomonas gallinarum, 5'-TAACCGTAGTAATTCTAGGGC-3' y 5'-AACGTTAATATACGCTATTGG-3' para la

determinación de Blastocystis sp.

15. Procedimiento para la determinación de la influencia de sustancias o mezclas de sustancias sobre células protozoarias de una especie de protozoo seleccionada del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp. que comprende las etapas de:

- proporcionar un cultivo clonal de protozoos según la reivindicación 1 ó 2,

- eventualmente ajustar el recuento de células del cultivo de protozoos,

- poner en contacto y cultivar el cultivo clonal de protozoos con un medio de cultivo tal como se define en las reivindicaciones 7 y 10 a 12,

- añadir al menos una sustancia o al menos una mezcla de sustancias, que puede ejercer potencialmente una influencia sobre células protozoarias,

- determinar el recuento de células protozoarias en el cultivo de protozoos,

- comparar el recuento de células protozoarias antes y después de la adición de la al menos una sustancia o de la al menos una mezcla de sustancias.

16. Procedimiento para detectar una especie de protozoo seleccionada del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp. en una muestra que comprende las etapas de:

- proporcionar una muestra,

- poner en contacto la muestra con al menos un oligonucleótido específico para Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum o Blastocystis sp. o un anticuerpo dirigido contra Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum o Blastocystis sp.,

- eventualmente someter la muestra/mezcla de oligonucleótidos a una técnica de amplificación de ácido nucleico,

- detectar un producto de amplificación de ácido nucleico, una unión de oligonucleótido/células protozoarias o una unión de células protozoarias/anticuerpo.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque se usan los oligonucleótidos 5'-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3' y 5'-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3' para la determinación de Histomonas meleagridis, 5'-GCAATTGTTTCTCCAGAAGTG-3' y 5'-GATGGCTCTCTTTGAGCTTG-3' para la determinación de Tetratrichomonas gallinarum, 5'-TAACCGTAGTAATTCTAGGGC-3' y 5'-AACGTTAATATACGCTATTGG-3' para la determinación de Blastocystis sp.

18. Kit para la detección de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp. o anticuerpo dirigido contra una de estas células en una muestra que comprende:

a) células protozoarias clonales de una única especie de protozoo seleccionada del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp. o un anticuerpo dirigido contra células protozoarias de una única especie de protozoo seleccionada del grupo constituido por Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum y Blastocystis sp. y b) agentes para la detección de la unión de células protozoarias/anticuerpo.

19. Alimento para animales o aditivo de alimento para animales que comprende una vacuna según una de las reivindicaciones 3 a 6.