Procedimiento para la identificación de espacios de mejillón del género Mytilu.

El procedimiento de la invención permite diferenciar los mejillones del género Mytilus por el patrón electroforético observado en un gel de poliacrilamida tras la amplificación por PCR de un fragmento de la región que codifica la proteína polifenólica del pie empleando ADN extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados y la amplificación por PCR se lleva a cabo con el mismo trío de cebadores en las seis especies, generando distintos patrones de bandas específicos para cada una de las especies.

El trío de cebadores degenerados a utilizar con el procedimiento de la presente invención son aquellos que se identifican con las siguientes secuencias: Myti-A 5'-CATCWTACAAASCTATTAAgACAAC; Myti-B 5'-TgCTggATAACTTggCTTTg, Myti-C 5'-ggTTTATATgTTgggggATAAgTAg, siendo S equivalente a C o a G y W equivalente a T o a A.

PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACiÓN DE ESPECIES DE MEJILLÓN

DEL GÉNERO MYTILUS

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación de especies de mejillón del género Mytilus, siendo de aplicación en la industria alimentaria para la detección y autentificación de especies de mejillón.

Más en particular, la presente invención se refiere a un procedimiento sencillo para identificar especies de mejillón del género Mytilus, más específicamente de las especies M. californianus, M. coruscus, M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus, así como para la identificación de las combinaciones híbridas de cada una de estas especies, basándose el procedimiento en el análisis de la secuencia de gen que codifica la proteína polifenólica del pie del mejillón. Para lo cual, se emplea ADN extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados y se lleva a cabo una amplificación por PCR con el mismo trío de cebadores en las seis especies, generando distintos patrones de bandas específicos para cada una de las especies.

Tradicionalmente, la identificación de especies en productos de la pesca y de la acuicultura se ha fundamentado en el análisis de las características morfológicas de tales productos, características que a menudo muestran gran plasticidad debido a que están sujetas a influencias ambientales.

En el caso de los moluscos bivalvos y en concreto de los mejillones, la información morfológica proviene en buena parte de las conchas, por lo que, en productos manufacturados o procesados, la identificación se ve muy dificultada

o incluso impedida por la pérdida de las mismas, lo que posibilita la aparición de fraudes respecto a la sustitución de unas especies por otras de menor valor.

La explotación de mejillones en países extracomunitarios se ha visto incrementada enormemente en los últimos años y con ella se han multiplicado las importaciones de mejillón de las especies del género Mytilus distintas de Mytilus galloprovincialis (especie producida en España) , pero de elevada similitud morfológica: M. californianus, M. edulis, M. trossulus, M. chilensis y M. coruscus. Todo ello ha generado la necesidad de desarrollar técnicas y procedimientos que permitan la identificación unívoca de las especies comercializadas para garantizar el cumplimiento de las normativas de comercialización vigente y evitar fraudes al consumidor.

Ante esta necesidad, en los últimos años, en los productos de la pesca y de la acuicultura, se han empezado a aplicar métodos que se fundamentan en el estudio del ADN, ya que, a diferencia de lo que ocurre con otras biomoléculas como las proteínas, el ADN es una molécula más resistente a la degradación cuando se aplican tratamientos fisicoquímicos durante el procesado (calor, presión, etc.) ; se encuentra presente en todos los tejidos de los organismos y no muestra una expresión diferencial según el estadía de desarrollo del organismo (Martínez, 1. y col., 2005. FAO, Fisheries Technical Paper. N° 455: 73p) .

Los métodos para la identificación de especies basados en ADN generalmente hacen uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Mediante el diseño de cebadores apropiados se pueden amplificar directamente tramos de ADN que muestran variantes de longitud o bien se pueden amplificar series diferentes de fragmentos. En otros casos, el producto amplificado puede analizarse por diversos métodos para detectar polimorfismos. Entre éstos se incluye la secuenciación, la digestión con enzimas de restricción o el análisis SSCP (polimorfismo conformacional de cadena sencilla) . No obstante, a la hora de aplicar cualquier técnica molecular debe tenerse en cuenta que el ADN extraído de productos manufacturados a menudo no excede el tamaño de unos pocos cientos de pares de bases.

En el caso de los mejillones, y en concreto de los pertenecientes al género Mytilus, el primer estudio diseñado para la búsqueda de marcadores moleculares para la identificación de las especies M. e dulis , M. galloprovincalis y

M. trossulus fue desarrollado por Inoue y col. (1995) , que estudiaron la variabilidad de la proteína polifenólica del pie y diseñaron cebadores que producen fragmentos de ADN especie-específicos. En los años posteriores se realizaron diversos estudios en productos frescos que incluyeron más especies del género (Freire y coL, 2007. En: Genética y genómica en acuicultura, 115154) .

No obstante y a pesar de la gran importancia comercial que tiene el mejillón, existen pocos trabajos en los que se haya estudiado la identificación de todas estas especies en productos procesados o manufacturados. En 2006, Santaclara y col. aplicaron los cebadores diseñados por Inoue y col. (1995) Me15 y Me16-en la diferenciación de M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus. En una primera etapa, los autores diferencian M. edulis y M. trossulus mediante un análisis de polimorfismo de longitud de un fragmento del gen que codifica la proteína polifenólica del pie y, en un paso posterior, diferencian M. galloprovincialis y M. chilensis mediante un análisis PCR-RFLP empleando la enzima de restricción Aci l.

La Patente ES 2 255 343, "Anticuerpos monoclonales de ratón y su aplicación en la identificación específica de larvas en O del mejillón Mytilus galloprovincialis", describe la obtención de dos hibridomas (HYB-M36.5 e HYBM22.8) productores de los anticuerpos monoclonales de ratón M36.5 y M22.8 a partir de ratones Balb/C inmunizados con larvas de mejillón de dos días de vida (en O) de la especie Mytilus galloprovincialis.

Sería por tanto deseable disponer de una técnica rápida, sencilla y fiable que permita identificar las distintas especies que se agrupan dentro del género Mytilus, tanto en producto fresco como en procesado y/o manufacturado.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es poner a disposición un procedimiento sencillo para identificar especies de mejillón del género Mytilus, más específicamente de las especies M. californianus, M. coruscus, M. chilensis,

M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus, así como para la identificación de

las combinaciones híbridas de cada una de estas especies, basándose el procedimiento en el análisis de la secuencia de gen que codifica la proteína polifenólica del pie del mejillón.

Para ello, se emplea ADN extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados y se lleva a cabo una amplificación por PCR con el mismo trío de cebadores en las seis especies, generando distintos patrones de bandas específicos para cada una de las especies.

Una de las novedades más desatacadas del procedimiento de la invención frente a los anteriormente descritos radica en el empleo simultáneo de tres cebadores nuevos para la amplificación con PCR de una región codificante del gen de la proteína polifenólica del pie.

Descripción de la invención

El objeto de la presente invención es poner a disposición un procedimiento sencillo para identificar especies de mejillón del género Mytilus, en concreto M. californianus, M. coruscus, M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus, así como para la identificación de las combinaciones híbridas de cada una de estas especies, donde el procedimiento se basa en el análisis de la secuencia de gen que codifica la proteína polifenólica del pie del mejillón mediante la utilización simultánea de tres nuevos cebadores nuevos para la amplificación con PCR de una región codificante del gen de la proteína polifenólica del pie.

Para ello, se emplea ADN extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados y la amplificación por PCR se lleva a cabo con el mismo trío de cebadores en las seis especies, generando distintos patrones de bandas específicos para cada una de las especies.

El procedimiento de la invención permite diferenciar los mejillones del género Mytilus por el patrón electroforético observado en un gel de poliacrilamida tras la amplificación por PCR de un fragmento de la región que codifica la proteína polifenólica del pie. Para ello, se emplea AON extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados... [Seguir leyendo]