Conjunto de oligonucleótidos para su uso en la detección específica de Mycobacterium avium ssp.

paratuberculosis (MAP) en muestras fecales, de tejidos y de órganos mediante PCR en tiempo real, dondelos oligonucleótidos presentan las siguientes secuencias de nucleótidos:

SEQ ID NO:1 primer forward ISMav2 5'-CGG CAA AAT CGA GCA GTT TC-3'

SEQ ID NO:2 primer reverse ISMav2 5'-TGA GCC GGT GTG ATC ATC TTT-3'

SEQ ID NO:5 primer forward F57 5'-TAC GAG CAC GCA GGC ATT C-3'

SEQ ID NO:6 primer reverse F57 5'-CGG TCC AGT TCG CTG TCA T-3'

Procedimiento para la detección de la paratuberculosis.

La presente invención se refiere a un método para la detección específica y sensible de Mycobacterium avium ssp. Paratuberculosis (MAP) en muestras de órganos, de tejidos y fecales con un método de PCR en tiempo real usando ácido desoxirribonucleico genómico (ADN) de un marcador adecuado.

Estado de la técnica El Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) fue descrito por primera vez en 1895 como agente etiológico en una enfermedad inflamatoria intestinal crónica de una vaca en Alemania. El nombre “enfermedad de John” o “Johne’s Disease”, en honor a su descubridor, fue introducido para esa paratuberculosis (ParaTB) que aparece en rumiantes, pero también en otros mamíferos. Se trata de una enfermedad presente en casi todo el mundo que causa grandes daños económicos.

Debido a los cambios patomorfológicos similares a los de la enfermedad inflamatoria intestinal crónica en humanos denominada enfermedad de Crohn (Morbus Crohn – MC) , surgió desde comienzos del siglo pasado la sospecha de que estas micobacterias pudieran desempeñar un papel en la etiología de la infección. El nombre se debió a la descripción de ocho casos de ileítis por Crohn, Ginzburg y Oppenheimer en 1932 en el hospital Monte Sinaí (Mount Sinai Hospital) en Nueva York. La primera descripción exacta del desarrollo clínico se realizó ya en 1913 por Dalziel en Glasgow. La inflamación se va presentando en brotes e implica para las personas afectadas una considerable reducción de su calidad de vida. La tasa de letalidad es de aproximadamente un 6 %. Un estudio multicéntrico en Europa encontró que la incidencia, es decir, la cantidad de nuevos casos de enfermedad de Crohn, asciende a 5, 6 casos por cada 100.000 habitantes al año; de modo que son aproximadamente 200.000 las personas afectadas.

Para Alemania se estimó una prevalencia de MC de 1/500 a 1/800, lo que equivale a aproximadamente 200.000 personas afectadas. La incidencia es de 5, 2 por 100.000 habitantes. El coste total se calcula en 20.000 ? por año y paciente, lo que asciende a una suma de aproximadamente 2 mil millones de euros al año en Alemania. Las similitudes entre los aspectos clínicos e histológicos de la paratuberculosis bovina y la tuberculosis humana intestinal y la enfermedad de Crohn no se pueden negar, sobre todo porque se pudo extraer MAP de muestras de tejidos de pacientes. Con la mejora de los métodos de detección y la introducción del método PCR, se logró comprobar cada vez más frecuentemente MAP en animales y humanos enfermos.

El elemento de inserción “IS900” del genoma MAP fue durante mucho tiempo el estándar reconocido en el diagnóstico biológico molecular. Los trabajos científicos se basan en el uso exclusivo de 5 distintos pares de primers. Se trata, en concreto, de IS900/150C//IS900/921, p36//p1, MK5/MK6, P90//P91 y P21/P8. Sin embargo, se describen reacciones cruzadas con los así llamados elementos “IS900like” de otros organismos, que hacen que este marcador sea inadecuado para la detección específica de MAP. Varios trabajos científicos según el estado de la técnica describen, sin embargo, el desarrollo de métodos de PCR en tiempo real basados en IS900. Estos métodos combinan los oligonucléotidos utilizados en la PCR convencional con los materiales marcadores conocidos del método ELISA, como, por ejemplo, colorantes fluorescentes o marcadores radioactivos, como se indica, por ejemplo, en DE 102 24 338 A1 para la detección de MAP. Sin embargo, estos métodos carecen todavía de la especificidad necesaria para la detección fiable de MAP y son susceptibles a contaminaciones o a falsos resultados positivos.

De trabajos científicos se conoce otro marcador más para el MAP, a saber, la secuencia de inserción ISMav2 del genoma MAP. Si bien la secuencia ISMav2 no muestra ninguna similitud con otras secuencias de inserción micobacteriales, muestra sin embargo una identidad del 50% con un transposón potencial de Streptomyces coelicolor, de modo que no se pueden excluir posibles reacciones cruzadas en el análisis de pruebas biológicas.

De DE 10 2005 001 788 A1 se sabe también que la secuencia F57 del genoma MAP es un marcador altamente específico para el MAP, y que con ello es una estructura objetivo para métodos de detección de PCR selectivos. DE 696 27 625 T2 revela el gen dnaJ, un gen de la proteína de choque térmico para la detección y determinación de micobacterias.

Sin embargo, las secuencias de marcadores F57 y dnaJ, ya solo por las reacciones cruzadas, no son apropiadas para su aplicación en los métodos de PCR en tiempo real para la detección específica y fiable de MAP en pruebas biológicas.

Otra desventaja del estado de la técnica actual es que la detección de MAP se efectúa sobre todo a partir de la leche, como se revela, por ejemplo, en DE 102 24 338 A1. La leche es una prueba biológica muy fácil de analizar, con muy pocos microorganismos contaminantes, que no presenta sustancias inhibidoras de la reacción PCR, de manera que la preparación de la prueba y la ejecución de la reacción PCR no precisan de grandes requisitos.

No obstante, es necesario analizar otras muestras biológicas, como fecales, de órganos y de tejidos, ya que no todos los animales (ni tampoco los humanos) que como potenciales portadores de paratuberculosis deben ser rutinariamente examinados dan leche.

Los expertos son conscientes de que el análisis de muestras biológicas complejas, como fecales, de órganos y de tejidos precisa de requisitos especiales y un método conocido de análisis de leche no puede ser transferido directamente.

El problema de la reacción cruzada, la neutralización y de la contaminación general con otros microorganismos es muy grande en muestras fecales que presentan una composición compleja. En general, no se desea un nuevo enriquecimiento del agente patógeno en un medio de cultivo, ya que tiene que asegurarse un diagnóstico rápido y el cultivo de MAP requiere mucho tiempo.

En el estado actual de la técnica no se conoce ningún método que revele satisfactoriamente una detección automatizable, específica y fiable de MAP en muestras biológicas, sobre todo fecales, de órganos y de tejidos, utilizando PCR en tiempo real.

Objetivo

El objetivo de la presente invención es, por lo tanto, eliminar las desventajas descritas del estado actual de la técnica y proporcionar un método mejorado de PCR en tiempo real para la detección específica y fiable de MAP en muestras fecales, de órganos y de tejidos, así como un kit de prueba que permita una aplicación automatizada del método.

El objetivo se logra según la presente invención mediante un método según las reivindicaciones 2-10 y un kit de prueba según las reivindicaciones 11-16, bajo el uso de oligonucleótidos especiales según la reivindicación 1.

El método según la presente invención presenta con la aplicación de la PCR en tiempo real muchas ventajas, por ejemplo, la aplicación de un método de extracción de ADN especial y seguro para muestras fecales, de órganos y de tejidos que puede aplicarse automatizadamente para un elevado número de muestras en un tiempo determinado. Falsas reacciones negativas o reacciones cruzadas pueden excluirse casi por completo gracias a la óptima selección de oligonucleótidos como primers y a la amplificación simultánea de dos estructuras marcadoras en el gen del MAP. Además, en la PCR en tiempo real, se obtiene mediante la comparación con un "control interno de amplificación (CIA) ", una cuantificación exacta del ADN específico amplificado del MAP. De esta manera, se obtiene como resultado un método mejorado específico y a la vez sensible de PCR en tiempo real para la detección de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) .

Según la presente invención, se proporcionan y aplican combinadamente los primers óptimos para la amplificación de las secuencias de marcadores "ISMav2" y "F57" del genoma MAP en un método de PCR en tiempo real para la detección específica de ADN del MAP genómico de muestras fecales, de órganos y de tejidos. Para este proceso, es de gran importancia el tratamiento previo del material biológico.

Se proporcionará además un testkit correspondiente para la ejecución rutinaria y automatizada del método para un alto número de muestras en un tiempo determinado que incluye los primers óptimos y alternativamente también... [Seguir leyendo]

1. Conjunto de oligonucleótidos para su uso en la detección específica de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) en muestras fecales, de tejidos y de órganos mediante PCR en tiempo real, donde los oligonucleótidos presentan las siguientes secuencias de nucleótidos:

SEQ ID NO:1 primer forward ISMav2 5’-CGG CAA AAT CGA GCA GTT TC-3’ SEQ ID NO:2 primer reverse ISMav2 5’-TGA GCC GGT GTG ATC ATC TTT-3’ SEQ ID NO:5 primer forward F57 5’-TAC GAG CAC GCA GGC ATT C-3’ SEQ ID NO:6 primer reverse F57 5’-CGG TCC AGT TCG CTG TCA T-3’

2. Método para la detección específica de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) en muestras fecales, de tejidos y de órganos mediante PCR en tiempo real, donde se detectan las secuencias de marcadores ISMAV2 SEQ ID NO:9 y F57 SEQ ID NO:10 del genoma MAP y se aplican los oligonucleótidos SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 según la reivindicación 1.

3. Método según la reivindicación 2, donde las muestras fecales, de tejidos y de órganos son de procedencia bovina, porcina, avícola o humana.

4. Método según las reivindicaciones 2 y 3, donde para la preparación de las muestras fecales, de tejidos y de órganos se utilizan reactivos que reducen el contenido de inhibidores de PCR y que contienen proteinasa K.

5. Método según las reivindicaciones 2 a 4, donde se aisla ADN de las muestras fecales, de tejidos y de órganos.

6. Método según las reivindicaciones 2 a 5, donde el PCR en tiempo real se lleva a cabo en presencia de un control interno de amplificación.

7. Método según las reivindicaciones 2 a 6, donde el control interno de amplificación contiene una cantidad definida de ADN de MAP.

8. Método según las reivindicaciones 2 a 7, donde el PCR en tiempo real se lleva a cabo en presencia de sondas que se unen al ADN amplificado y dependiendo de la cantidad de ADN unido generan señales que son medidas y cuantificadas.

9. Método según la reivindicación 8, donde como sonda se utiliza la TaqManmgb según SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:7 o la sonda LNA según SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:8.

10. Método según la reivindicación 9, donde las sondas están unidas con colorante fluorescente.

11. Kit de prueba para la detección específica de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) en muestras fecales, de tejidos y de órganos mediante PCR en tiempo real, donde el kit de prueba comprende oligonucleótidos para la amplificación de ADN de MAP según la reivindicación 1, los cuales hibridizan con secuencias genéticas para ISMav2 y F57 del genoma MAP.

12. Kit de prueba según la reivindicación 11, donde el kit de prueba comprende sondas que están unidas al ADN amplificado y dependiendo de la cantidad de ADN unido generan señales que son medidas y cuantificadas.

13. Kit de prueba según las reivindicaciones 11 y 12, donde el kit de prueba comprende la sonda TaqManmgb según SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:7 o la sonda LNA según SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:8.

14. Kit de prueba según las reivindicaciones 11 a 13, donde las sondas están unidas con colorante fluorescente.

15. Kit de prueba según las reivindicaciones 11 a 14, donde el kit de prueba comprende reactivos para la obtención del ADN genómico completo de muestras fecales, de órganos y de tejidos, donde los reagentes reducen el contenido de inhibidores de PCR y que contienen proteinasa K.

16. Kit de prueba según las reivindicaciones 11 a 13, donde el kit de prueba muestra un control interno de amplificación que contiene una cantidad definida de ADN de MAP.