Procedimiento para la detección de la miopatía equina por almacenamiento de polisacáridos.

Un procedimiento para la detección de la presencia de la miopatía por almacenamiento de polisacáridos (MAPS) en un caballo,

que comprende la identificación en una muestra de ácido nucleico de un nucleótido 926 de caballo de la SEC ID NO: 1, en el que la presencia de un nucleótido adenina (A) en el nucleótido 926 en uno o en ambos alelos es indicativa de que el caballo tiene predisposición a padecer o padece MAPS.

Procedimiento para la detección de la miopatía equina por almacenamiento de polisacáridos

Antecedentes de la invención La miopatía por almacenamiento de polisacáridos (MAPS) es una enfermedad muscular debilitante en muchas y diferentes razas de caballos. Los datos disponibles indican que aproximadamente el 10% de los caballos de raza Quarter Horses y el 36% de los caballos de raza Belgian Draft Horses están afectados. Los signos clínicos varían aunque pueden ir desde atrofia muscular y debilidad progresiva en las razas Draft Horse hasta espasmos musculares agudos tras el ejercicio y daño celular en los Quarter Horses y en otras razas. Todas las formas de MAPS en caballos están fundamentalmente asociadas a depósitos de un polisacárido anormal en fibras musculares esqueléticas que se aprecian por tinción histoquímica de biopsias musculares. La MAPS también se caracteriza por unos niveles de hasta cuatro veces superiores a los niveles normales de glucógeno en el músculo esquelético. Se sabe que las mutaciones en los genes del metabolismo de la glucosa y del glucógeno causan diversos tipos de enfermedades por almacenamiento de glucógeno (glucogénesis) en seres humanos y en especies animales de las cuales varias son similares histológicamente a la MAPS. Sin embargo, ninguno de estos genes parecen ser responsables de la MAPS.

El diagnóstico actual de la MAPS en caballos se basa en los signos clínicos de espasmos musculares o atrofia progresiva (dependiendo de la raza) , frecuentemente con niveles séricos elevados enzimas musculares, combinado con hallazgos histopatológicos de polisacárido anormal en estos cortes de biopsias de músculo esquelético.

Las biopsias musculares son invasivas, precisan de personal veterinario experto para su realización, son relativamente caras para el propietario y requieren de un histopatólogo muscular especializado para su interpretación. Además, aunque el análisis de la biopsia muscular ha sido una herramienta diagnóstica extremadamente fiable, no es 100% específica ni sensible y nunca lo podrá ser.

Por consiguiente, a pesar de lo anterior, existe una necesidad en la técnica de pruebas diagnósticas adicionales para el diagnóstico de la MAPS en caballos.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un procedimiento para la detección de la presencia de un biomarcador asociado a la miopatía por almacenamiento de polisacáridos (MAPS) . En una realización de la invención, el procedimiento implica la obtención de una muestra fisiológica de un caballo, en el que la muestra comprende ácido nucleico y la determinación de la presencia del biomarcador. Como se usa en la presente memoria, el término "muestra fisiológica" se entiende que se refiere a una muestra biológica obtenida de un mamífero que contiene ácido nucleico. Por ejemplo, una muestra fisiológica puede ser una muestra recogida de un caballo individual, tal como incluyendo, pero sin limitación, por ej., una muestra celular, tal como una célula sanguínea, por ej., un linfocito, una célula de sangre periférica, una muestra recogida de la médula espinal, una muestra de tejido, tal como tejido cardíaco o tejido muscular, por ej., músculo cardíaco o esquelético, una muestra de un órgano, por ej., hígado o piel, una muestra de pelo, por ej., una muestra de pelo con raíz y/o una muestra de líquido, tal como sangre.

Ejemplos de razas de caballos afectadas incluyen, pero sin limitación, Quarter Horses, Percheron Horses, Paint Horses, Draft Horses, Warmblood Horses u otras razas relacionadas o no relacionadas. El término "raza relacionada" se usa en la presente memoria para referirse a razas que están relacionadas con una raza, tal como Quarter Horse, Draft Horse o Warmblood Horse. Dichas razas incluyen, pero sin limitación, razas de cría, tales como el American Paint, el Appaloosa y el Palomino. El término "Draft Horse" incluye muchas razas incluyendo, pero sin limitación, los caballos Cly desdale, Belgian, Percheron y Shire. El término "media sangre" es también un término genérico que incluye varias razas diferentes. "Media sangre" simplemente distingue este tipo de caballo de los caballos de "sangre fría" (caballos de tiro) y de los de "sangre caliente" (los pura sangre y los árabes) . El procedimiento de la presente invención también incluye caballos de razas cruzadas o mixtas.

El término "biomarcador" se define generalmente como un indicador biológico, tal como una característica molecular particular, que puede afectar o estar relacionada con el diagnóstico o predicción de la salud de un individuo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones de la presente invención, el biomarcador comprende un gen mutante de la enzima glucógeno sintasa 1 (GSY1) equina, tal como el alelo polimórfico de GYS1 que tiene una sustitución de G por A en el nucleótido 926 en el exón 6. El gen GYS1 codifica para una enzima que tiene una sustitución R (arginina) por H (histidina) en el residuo aminoácido 309.

"Sonda oligonucleotídica" se puede referir a un segmento de ácido nucleico, tal como un cebador, que es útil para amplificar una secuencia del gen GYS1 que es complementaria a, e hibrida específicamente con una secuencia particular de GYS1, o con una región de ácido nucleico que flanquea a GYS1.

Como se usa en la presente memoria, el término "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria, compuesto por monómeros (nucleótidos) que contienen un azúcar, fosfato, y una base que es una purina o pirimidina. Salvo que se especifique concretamente, el término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos naturales. Salvo que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas conservadoramente de la misma (por ej., sustitución en un codón degenerado) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones en un codón degenerado pueden conseguirse generando secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones seleccionado (o todos) está sustituida con residuos de una base mixta y/o desoxiinosina.

Un "fragmento de ácido nucleico" es una fracción de una molécula de ácido nucleico dada. El ácido desoxirribonucleico (ADN) en la mayoría de los organismos es el material genético, mientras que el ácido ribonucleico (ARN) interviene en la transferencia de la información contenida en el ADN en proteínas. El término "secuencia de nucleótidos" se refiere a un polímero de ADN o ARN que puede ser monocatenario o bicatenario, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas, capaces de incorporarse a polímeros de ADN o ARN.

Los términos "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "fragmento de ácido nucleico", "secuencia o segmento de ácido nucleico" o "polinucleótido" pueden usarse también indistintamente con gen, ADNc, ADN y ARN codificado por un gen, por ej., ADN genómico e incluso secuencias de ADN sintético. El término también incluye secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN.

En una realización de la presente invención, el procedimiento también incluye la puesta en contacto de la muestra con al menos una sonda oligonucleotídica para formar un ácido nucleico hibridado y la amplificación del ácido nucleico hibridado. La "Amplificación" utiliza procedimientos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , ligación y amplificación (o reacción en cadena de la ligasa, LCR) , amplificación por desplazamiento de hebra, amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico y métodos de amplificación basados en el uso de la Q-beta replicasa. Estos métodos son bien conocidos y muy utilizados en la técnica. Los reactivos y el hardware para realizar la PCR están disponibles en el mercado. Por ejemplo, en determinadas realizaciones de la presente invención el exón 6 del gen de la enzima glucógeno sintasa 1 equina (también denominado GSY1) , o una porción del mismo, se puede amplificar mediante PCR. En otra realización de la presente invención, se inmoviliza al menos una sonda oligonucleotídica en una superficie sólida.

Los procedimientos de la presente invención se pueden usar para detectar la presencia de un biomarcador asociado a la miopatía equina... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la detección de la presencia de la miopatía por almacenamiento de polisacáridos (MAPS) en un caballo, que comprende la identificación en una muestra de ácido nucleico de un nucleótido 926 de caballo de la SEC ID NO: 1, en el que la presencia de un nucleótido adenina (A) en el nucleótido 926 en uno o en ambos alelos es indicativa de que el caballo tiene predisposición a padecer o padece MAPS.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la puesta en contacto de la muestra con al menos una sonda oligonucleotídica para formar un ácido nucleico hibridado y la amplificación del ácido nucleico hibridado.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que se amplifica el exón 6 de la enzima glucógeno sintasa 1 o una parte de la misma.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la amplificación del ácido nucleico hibridado se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa, la amplificación por desplazamiento de mella, la reacción en cadena de la ligasa o la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que al menos una sonda oligonucleotídica se inmoviliza sobre una superficie sólida.

6. Un procedimiento para la detección de un alelo de la miopatía por almacenamiento de polisacáridos (MAPS) en un caballo, que comprende la identificación en una muestra de ácido nucleico del nucleótido 926 de caballo de la SEC ID NO: 1, en el que la presencia de un nucleótido adenina (A) en el nucleótido 926 en uno o en ambos alelos es indicativa de que el caballo tiene predisposición a padecer o padece MAPS.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, que comprende además la puesta en contacto de la muestra con al menos una sonda oligonucleotídica para formar un ácido nucleico hibridado y la amplificación del ácido nucleico hibridado.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que se amplifica el exón 6 de la enzima glucógeno sintasa 1 o una parte de la misma.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la amplificación del ácido nucleico hibridado se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa, la amplificación por desplazamiento de mella, la reacción en cadena de la ligasa o la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que al menos una sonda oligonucleotídica se inmoviliza sobre una superficie sólida.

11. Un procedimiento para la detección de la presencia de un biomarcador asociado a la miopatía equina por almacenamiento de polisacáridos (MAPS) , que comprende la determinación de la presencia del biomarcador en una muestra fisiológica de un caballo, en el que la muestra comprende ácido nucleico y en el que el biomarcador representa un polimorfismo/mutación en el gen GYS1 equino codificante identificado por genotipificación.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, que comprende además la puesta en contacto de la muestra con al menos una sonda oligonucleotídica para formar un ácido nucleico hibridado y la amplificación del ácido nucleico hibridado.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que se amplifica el exón 6 de la enzima glucógeno sintasa 1 (GYS1) o una parte de la misma.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la amplificación del ácido nucleico hibridado se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa, la amplificación por desplazamiento de mella, la reacción en cadena de la ligasa o la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que al menos una sonda oligonucleotídica se inmoviliza sobre una superficie sólida.

16. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el biomarcador comprende un gen GYS1 equino que tiene una A en el nucleótido 926 del exón 6.

17. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el gen GYS1 codifica para una enzima que tiene un H en residuo aminoácido 309.

18. Un procedimiento para el diagnóstico de la miopatía por almacenamiento de polisacáridos (MAPS) en un caballo, que comprende la detección de la presencia de un biomarcador en una muestra fisiológica del caballo, en el que la presencia del biomarcador es indicativa de la enfermedad y el biomarcador representa un polimorfismo/mutación en el gen GYS1 equino codificante identificado por genotipificación.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la muestra comprende ácido nucleico.

20. El procedimiento de la reivindicación 18, que comprende además la puesta en contacto de la muestra con al menos una sonda oligonucleotídica para formar un ácido nucleico hibridado y la amplificación del ácido nucleico hibridado.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que se amplifica el exón 6 de la enzima glucógeno sintasa 1 5 (GYS1) o una parte de la misma.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la amplificación del ADN hibridado se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa, la amplificación por desplazamiento de mella, la reacción en cadena de la ligasa o la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico.

23. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el biomarcador comprende un gen GYS1 equino que tiene 10 una A en el nucleótido 926 del exón 6.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que el gen GYS1 codifica para una enzima que tiene un H en el residuo aminoácido 309.

25. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el biomarcador es una proteína GYS 1.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la proteína GYS1 codifica para una enzima que tiene un H en 15 el residuo aminoácido 309.