Procedimiento para la desacilación de lipopéptidos cíclicos.

Una acilasa de lipopéptidos cíclicos obtenida a partir de una cepa de microorganismo perteneciente al género Streptomyces,

en la que la cepa de microorganismo productora de acilasa es Streptomyces sp. nº 6907, depositada en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana (NIBH) bajo el número de acceso FERM BP-5809, y la acilasa presenta las características siguientes:

1) Actividad:

Esta enzima cataliza la desacilación del resto acilo lipídico del compuesto lipopeptídico cíclico representado por la sustancia FR901379 y los análogos de FR901379, tales como equinocandina B y aculeacina A.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07114433.

Solicitante: ASTELLAS PHARMA INC..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 3-11, NIHONBASHI-HONCHO 2-CHOME, CHUO-KU TOKYO JAPON.

Inventor/es: YAMASHITA, MICHIO, UEDA, SATOSHI, EZAKI, MASAMI, HASHIMOTO, SEIJI, TANAKA,MIHO, SAKAMOTO,KAZUTOSHI, OOHATA,NOBUTAKA, TSUBOI,MASARU.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K7/56 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 7/00 Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados. › ciclados de forma distinta que por el ácido diamino-2,4 butanoico.
  • C12N9/80 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces amida de las amidas alifáticas.

PDF original: ES-2379107_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la desacilación de lipopéptidos cíclicos Esta solicitud es una solicitud divisional de la patente EP-97905455.8. CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a la tecnología enzimática. La presente invención se refiere a una nueva acilasa capaz de desacilar la cadena lateral acilo de un compuesto lipopeptídico cíclico y a un procedimiento de desacilación en el que se utilice la misma.

Más concretamente, la invención se refiere a una nueva acilasa adaptada para desacilar la cadena lateral acilo de la sustancia FR901379 (descrita en la patente japonesa Kokai Tokkyo Koho H3-184921) , la cual es producida por el microorganismo Coleophoma sp. F-11899 (FERM BP-2635) , o de un análogo de la sustancia FR901379 y a un procedimiento de desacilación en el que se use la misma.

TÉCNICA ANTERIOR

Existe una necesidad constante de una acilasa capaz de desacilar la cadena lateral acilo de un compuesto lipopeptídico cíclico, especialmente de dicha sustancia FR901379 o análogo, con una buena eficacia.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han investigado extensamente en búsqueda de una nueva acilasa capaz de desacilar la cadena lateral acilo de un lipopéptido cíclico representado por la sustancia FR901379 o sus análogos, tales como equinocandina B y aculeacina A. Como resultado, han descubierto una acilasa producida por Streptomyces anulatus con la cual se alcanza eficazmente la desacilación objetivo.

Esta nueva acilasa de lipopéptidos cíclicos y el procedimiento de desacilación en el cual se utilice la misma se describen ahora en cuanto a sus aspectos principales.

En primer lugar, se describe el microorganismo productor de la acilasa de lipopéptidos cíclicos.

El microorganismo productor de la nueva acilasa de lipopéptidos cíclicos es Streptomyces sp. 6907 (FERM BP-5809 depositado en el NIBH tal como se menciona más adelante) .

A continuación se describen las características de esta cepa.

La cepa productora de la nueva acilasa de lipopéptidos cíclicos denominada Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) (denominada en lo sucesivo de forma abreviada cepa nº 6907 (FERM BP-5809) ) se aisló por primera vez de una muestra de tierra recogida en la prefectura de Fukushima. A continuación se describen las características bacteriológicas de esta cepa nº 6907 (FERM BP-5809) .

Características de cultivo

En la tabla 5 se resumen las características de cultivo de la cepa nº 6907 (FERM BP-5809) en agar extracto de levadura-extracto de malta, agar avena, agar almidón-sales inorgánicas, agar glicerina-asparagina, agar peptonaextracto de levadura-hierro y agar tirosina tras una incubación de 14 días a 30 º C y los resultados obtenidos por microscopía óptica y electrónica de barrido para los crecimientos respectivos. Las descripciones de color presentadas a continuación corresponden a la nomenclatura definida en el Methuen Handbook of Colour, Methuen, Londres, 1978.

Tabla 5. Características de cultivo de la cepa nº 6907 (FERM BP-5809)

Medio Características de cultivo Agar extracto de levadura-extracto de malta (ISP-2) C: bueno A: abundante, gris amarillento, blanco (4A2) R: naranja grisáceo (5B6) S: ninguno Agar avena (ISP-3) C: moderado A: abundante, gris azulado (22C2) R: marrón claro (4D4) S: ninguno Agar almidón-sales inorgánicas (ISP-4) C: bueno A: abundante, gris azulado (19C2) R: marrón (6F4) S: ninguno Agar glicerina-asparagina (ISP-S) C: bueno A: abundante, gris azulado (22B2) R: marrón rojizo (8E4) S: ninguno Agar peptona-extracto de levadura-hierro (ISP6) C: moderado A: ninguno R: marrón grisáceo (9F3) S: marrón oscuro Agar tirosina (ISP-7) C: bueno A: moderado, blanco amarillento (4A2) R: magenta oscuro (13F3) S: marrón oscuro Códigos: C: crecimiento, A: micelio aéreo, R: color del reverso, S: pigmento soluble

El color del micelio aéreo se encontraba entre gris amarillento y gris azulado, el color de crecimiento del reverso estaba entre marrón claro y marrón y los pigmentos intracelulares no eran sensibles a pH. En caldo de triptona-extracto de levadura, agar peptona-extracto de levadura-hierro y agar tirosina se produjeron pigmentos melanoides.

Características fisiológicas

En la tabla 6 se resumen las características fisiológicas de la cepa nº 6907 (FERM BP-5809) .

Tabla 6. Características fisiológicas de la cepa nº 6907 (FERM BP-5809)

Parámetros Resultados Intervalo de temperatura para el crecimiento Licuefacción de gelatina Coagulación de leche Peptonización de leche Hidrólisis de almidón Producción de pigmentos melanoides 9, 0 - 40, 0 º C + + -+ + Utilización de carbono: D-glucosa + L-arabinosa + D-xilosa + Inositol + Manitol + D-fructosa + L-ramnosa + Sacarosa + Rafinosa + +: positivo, ±: débilmente positivo, -: negativo

Esta cepa utilizó todas las fuentes de carbono ensayadas. No peptonizó la leche. El intervalo de temperatura para el 10 crecimiento se encontraba entre 9, 0 y 40, 0 º C.

El micelio vegetativo de la cepa nº 6907 (FERM BP-5809) se desarrolló bien y se ramificó irregularmente pero sin fragmentarse. El micelio aéreo que se extendía desde el micelio vegetativo se ramificó monopódicamente para constituir cadenas de esporas alargadas. La morfología de las cadenas de esporas del micelio aéreo era recta-flexuosa o de bucles incompletos, perteneciendo así al tipo RF o RA de acuerdo con la clasificación de Pridham y col. (Pridham, T.G.

y col.: Appl. Microbiol., 6:54, 1958) . Cada cadena de esporas se compone de 20 o más esporas. La espora presenta una superficie lisa y es cilíndrica. El tamaño de las esporas es de 0, 5-0, 7 x 0, 7-1, 3 μm. No se observaron esclerocios, esporangios ni zoosporas.

Tipo de pared celular

En cuanto a la composición de aminoácidos de la pared celular, se analizó el lisado celular completo mediante el método de Becker y col. (Becker, B., M. P. Lechevalier, R. E. Gordon y H. A. Lechevalier: Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates: Appl. Microbiol., 12:421-423, 1964) y el método de Yamaguchi (Yamaguchi, T.: Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetes: J. Bacteriol., 89:444-453, 1965) . El análisis indicó la existencia de ácido LL-diaminopimélico. Por lo tanto, la pared celular de esta cepa se consideró de tipo I.

En base a la observación morfológica y el análisis químico anteriores, se consideró que la cepa nº (FERM BP-5809) pertenece al género Streptomyces de acuerdo con la clasificación taxonómica de Pridham y col. (Pridham, T. G. y col.: Appl. Microbiol., 6:54, 1958) . Por consiguiente, se compararon las características de esta cepa con las de Streptomyces species descritas en la bibliografía, a saber, en Shirling y col. (Shirling, E. B. y D. Gottlieb: Cooperative Description of Type Culture of Streptomyces. 2. Species descriptions from first study, Intern. J. Syst. Bacteriol., 18:69-189, 1968;

Shirling, E.B. y D. Gottlieb: Cooperative Description of Type Culture of Streptomyces. 3. Additional species descriptions from first and second studies, Intern. J. Syst. Bacteriol., 18:279-392, 1968; Shirling, E. B. y D. Gottlieb: Cooperative Description of Type Culture of Streptomyces. 4. Species descriptions from second, third and forth studies, Intern. J. Syst. Bacteriol., 19:391-512, 1969) ; Skerman y col. (Skerman, V. B., V. McGowan y P. H. A. Sneath: Approved List of 5 Bacterial Names, Amended Edition, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1989) ; y Moore y col. (Moore, W. E., E. P. Cato y L. V. H. Moore: Index of Bacterial and Yeast Nomencultural Changes, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1992) . La comparación no permitió indicar una especie con la cual se pudiera identificar y, por lo tanto, esta cepa se denominó Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) .

Esta Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) se depositó originalmente el 8 de marzo de 1996 en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana (NIBH, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón) (código ZIP 305) bajo el número de acceso FERM P-15506, y posteriormente se depositó de nuevo bajo el número de acceso FERM BP-5809 de acuerdo con el Tratado de Budapest del 3 de febrero de 1997.

La expresión "compuesto lipopeptídico cíclico" tal como se utiliza en esta memoria descriptiva se refiere a un compuesto que presenta un anillo polipeptídico... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una acilasa de lipopéptidos cíclicos obtenida a partir de una cepa de microorganismo perteneciente al género Streptomyces, en la que la cepa de microorganismo productora de acilasa es Streptomyces sp. nº 6907, depositada en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana (NIBH) bajo el número de acceso FERM BP-5809, y la acilasa presenta las características siguientes: 1) Actividad: Esta enzima cataliza la desacilación del resto acilo lipídico del compuesto lipopeptídico cíclico representado por la sustancia FR901379 y los análogos de FR901379, tales como equinocandina B y aculeacina A. 2) pH óptimo: pH 8 a 9; 10 3) Temperatura óptima para la actividad: aproximadamente 50 º C;

4) Inhibición, activación y estabilización: Metanol: La enzima es activada de forma dependiente de la concentración hasta un 10 % en la mezcla de reacción y es inhibida a concentraciones mayores. 5) Peso molecular:

Péptido grande: 61 kD 15 Péptido pequeño: 19 kD

6) Análisis de aminoácidos: Secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal Péptido grande:

Ser-Asn-Ala-Val-Ala-Phe-Asp-Gly-Ser-Thr-Thr-Val-Asn-Gly-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Gly-...

Péptido pequeño:

Gly-Ser-Gly-Leu-Ser-Ala-Val-Ile-Arg-Tyr-Thr-Glu-Tyr-Gly-Ile-Pro-His-His-Val-Ala-...

7) Especificidad por el sustrato La enzima actúa de catalizador para FR901379, equinocandina B y aculeacina A, pero no actúa sobre FR901469.

2. La acilasa de acuerdo con la reivindicación 1, la cual cataliza la desacilación del grupo acilo R1 de un compuesto 25 lipopeptídico cíclico con la siguiente fórmula general [I] o una sal del mismo:

en la que R1 es acilo; R2 es hidroxi o aciloxi; R3 es hidrógeno o hidroxi; R4 es hidrógeno o hidroxi; R5 es hidrógeno o hidroxisulfoniloxi y R6 es hidrógeno o carbamoílo; para producir un compuesto peptídico cíclico con la siguiente fórmula general [II] o una sal del mismo:

en la que R2, R3, R4, R5 y R6 son como se han definido anteriormente.

10 3. La acilasa de acuerdo con la reivindicación 2, en la que R1 es hidroxisulfoniloxi y R6 es carbamoílo.

4. Streptomyces sp. 6907 depositado en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana (NIBH) bajo el número de acceso FERM BP-5809.

15 5. Procedimiento para la producción de un compuesto peptídico cíclico o una sal del mismo, el cual comprende poner un compuesto lipopeptídico cíclico o su sal en contacto con una solución enzimática bruta o purificada de una acilasa producida por un microorganismo perteneciente al género Streptomyces para desacilar su resto acilo lipídico, en el que la acilasa es la acilasa de la reivindicación 1.

6. Procedimiento para la producción de un compuesto peptídico cíclico con la siguiente fórmula general (II) : en la que R2, R3, R4, R5 y R6 son los mismos grupos que los que se definen respectivamente más adelante, el cual comprende poner un compuesto lipopeptídico cíclico con la siguiente fórmula general [I]:

en la que R1 es acilo; R2 es hidroxi o aciloxi; R3 es hidrógeno o hidroxi; R4 es hidrógeno o hidroxi;

R5 es hidrógeno o hidroxisulfoniloxi y R6 es hidrógeno o carbamoílo, o una sal del mismo en un disolvente acuoso en contacto con una solución enzimática bruta o purificada de una acilasa obtenida mediante el cultivo de una cepa de microorganismo productora de acilasa perteneciente al género Streptomyces, en el que la acilasa es la acilasa de la reivindicación 1.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que R5 es hidroxisulfoniloxi y R6 es carbamoílo.

DOCUMENTOS INDICADOS EN LA DESCRIPCIÓN

En la lista de documentos indicados por el solicitante se ha recogido exclusivamente para información del lector, y no es parte constituyente del documento de patente europeo. Ha sido recopilada con el mayor cuidado; sin embargo, la EPA no asume ninguna responsabilidad por posibles errores u omisiones.

Documentos de patente indicados en la descripción

• EP 97905455 A [0001] • WO 9219648 A [0065]

• FR 901379 [0004] • JP H4228072 B [0066]

• JP H3184921 B [0004] [0021] • WO 9630399 A [0066] Documentos de patente citados en la descripción

 

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