Ácido nucleico que comprende:

(i) una primera cadena de 15 a 30 nucleótidos de longitud que comprende la SEQ ID NO 4;

y

(ii) una segunda cadena de 15 a 30 nucleótidos de longitud;

donde al menos 12 nucleótidos de la primera y la segunda cadena son complementarios entre sí y forman un ácido nucleico bicatenario bajo condiciones fisiológicas y donde el ácido nucleico bicatenario puede reducir la expresión de una subunidad 2 (R2) de la ribonucleótido-reductasa en una célula mediante un mecanismo de ARN-interferencia.

Inhibidores de la subunidad 2 de la ribonucleótido-reductasa y utilizaciones de los mismos.

SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad de las solicitudes provisionales US nº 60/667.362 presentada el 31 de marzo de 2005, 60/695.931 presentada el 30 de junio de 2005 y 60/742.100 presentada el 2 de diciembre de 2005.

ANTECEDENTES

La ribonucleótido-reductasa (RNR) cataliza la reacción que produce 2'-desoxirribonucleótidos a partir de sus 5'-difosfatoribonucleósidos correspondientes. Esta reacción es un paso limitante en la ruta de producción de 2'desoxirribonucleósido-5'-trifosfatos y es necesaria para la replicación del ADN. La RNR humana consiste en dos subunidades, R1 y R2, siendo necesaria para la actividad enzimática la expresión de ambas proteínas. Las proteínas R1 y R2 son codificadas por genes diferentes en cromosomas independientes y, lo más importante, sus ARNm son expresados de forma diferenciada durante todo el ciclo celular. La proteína R1 es estable durante todo el ciclo celular, mientras que la R2 sólo es expresada durante la fase tardía G1/temprana S cuando se produce la replicación de ADN (Engstrom y col., 1985) .

La inhibición de la R2 ha sido un objetivo de las terapias contra el cáncer y antivirales. No obstante, sería deseable disponer de nuevos inhibidores de la R2 dirigidos para el tratamiento de trastornos de proliferación celular tales como el cáncer o de infecciones por agentes patógenos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA SOLICITUD

Así, la presente solicitud proporciona inhibidores de la R2 y métodos y composiciones relacionados con los mismos que pueden lograr la inhibición de R2 en células diana. Las células diana incluyen en particular aquellas que experimentan una proliferación no deseada, como células cancerosas o tumorales, células que experimentan un crecimiento y/o proliferación excesivo asociado a determinadas enfermedades o estados (por ejemplo células T en enfermedades autoinmunes o rechazos en trasplantes) y agentes patógenos. Los inhibidores de la R2 de la solicitud pueden inhibir la R2 reduciendo la expresión de la R2 o una función biológica de la R2 (por ejemplo una actividad enzimática de la R2) .

Un inhibidor de la R2 puede ser un ácido nucleico, una molécula pequeña, un péptido que incluye un anticuerpo, un derivado peptídico o un péptido mimético.

Ciertas realizaciones se refieren a inhibidores de R2 que son ácidos nucleicos. La invención proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden al menos una parte que se hibrida en un transcripto de R2 bajo determinadas condiciones (por ejemplo fisiológicas o intracelulares) y reduce la expresión del gen diana en una célula. El transcripto del gen diana puede ser cualquier transcripto previo al corte y empalme (es decir, incluye intrones) o posterior al corte y empalme, así como cualquier variante de corte y empalme. El transcripto del gen diana puede tener cualquiera de las secuencias indicadas como SEQ ID NO: 1-3. Ejemplos de categorías de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, constructos de ARNi y constructos de ácido nucleico catalíticos. El ácido nucleico puede ser mono- o bicatenario. El ácido nucleico bicatenario también puede incluir regiones protuberantes (overhang) o de no complementariedad, donde una u otra cadena es monocatenaria. Un ácido nucleico monocatenario puede incluir regiones de autocomplemetariedad, lo que significa que el compuesto forma una, así llamada, estructura de "horquilla" o de "tallobucle", con una región de estructura helicoidal doble. El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos complementaria a una región consistente en no más de 1.000, no más de 500, no más de 250, no más de 100 o no más de 50 nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos del gen diana, tal como cualquiera de las designadas como SEQ ID NO: 1-3 (Figuras 1-2) o cualquier homólogo (por ejemplo ortólogos y parólogos) o variante de las mismas. La región de complementariedad tendrá preferentemente al menos 8 nucleótidos y opcionalmente al menos 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos. Una región de complementariedad puede estar situada dentro de un intrón, una secuencia codificadora o una secuencia no codificadora del transcripto del gen diana. En general, el ácido nucleico tendrá una longitud de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 500 nucleótidos o pares de bases, opcionalmente dicha longitud será de aproximadamente 14 a aproximadamente 50 nucleótidos. El ácido nucleico puede ser un ADN, un ARN o un híbrido ARN:ADN. Cualquiera de las cadenas puede incluir una mezcla de ADN y ARN y también formas modificadas que no se pueden clasificar fácilmente como ADN o como ARN. Del mismo modo, el ácido nucleico bicatenario puede ser ADN:ADN, ADN:ARN o ARN:ARN y cualquier cadena también puede incluir una mezcla de ADN y ARN además de formas modificadas que no se pueden clasificar fácilmente como ADN o como ARN. El ácido nucleico puede incluir cualquiera de múltiples modificaciones, incluyendo una o más modificaciones del esqueleto (la parte azúcar-fosfato en un ácido nucleico natural, incluyendo enlaces internucleótido) o en la parte base (la parte purina o pirimidina de un ácido nucleico natural) . El ácido nucleico tendrá preferentemente una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 nucleótidos y con frecuencia incluirá una o más modificaciones para mejorar características tales como su estabilidad en suero, en una célula o en el lugar donde es probable que se administre el ácido nucleico, por ejemplo en el estómago en el caso de los ácidos nucleicos administrados vía oral y en los pulmones en caso de los ácidos nucleicos administrados por inhalación. En caso de un constructo de ARNi, la cadena complementaria al transcripto diana será generalmente un ARN o modificaciones del mismo. La otra cadena puede ser ARN, ADN o cualquier otra variación. La parte dúplex del constructo de ARNi con estructura de "horquilla" bicatenaria o monocatenaria tendrá preferentemente una longitud de 18 a 30 nucleótidos, opcionalmente de aproximadamente 21 a 27 nucleótidos. Los ácidos nucleicos catalíticos o enzimáticos pueden ser ribozimas o enzimas de ADN y también pueden incluir formas modificadas. Los ácidos nucleicos aquí descritos pueden inhibir la expresión del gen R2 diana aproximadamente en un 50%, 75%, 90% o más cuando entran en contacto con células bajo condiciones fisiológicas y en una concentración donde un control sentido o sin sentido tiene poco o ningún efecto. Las concentraciones preferentes para evaluar el efecto de los ácidos nucleicos son 1, 5 o 10 micromolar. Los ácidos nucleicos aquí descritos también pueden estudiarse en relación con sus efectos sobre los fenotipos celulares. En el caso de ciertas líneas celulares cancerosas, después de administrar los ácidos nucleicos dirigidos se puede medir la muerte celular o la disminución de la tasa de expansión. Preferentemente, la expansión celular se inhibirá en más de un 50% con una concentración experimentalmente significativa del ácido nucleico.

En ciertos aspectos, la solicitud proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los diversos inhibidores de R2, por ejemplo ácidos nucleicos dirigidos a un gen R2 (o ácidos nucleicos dirigidos) . En general, una composición farmacéutica incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender un ácido nucleico que se hibrida en el transcripto del gen diana bajo condiciones fisiológicas y disminuye la expresión del gen diana en una célula.

En determinadas secciones, la solicitud describe métodos para inhibir la expresión de un gen R2 en una célula. El método puede incluir poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un ácido nucleico que se hibrida en el transcripto de R2 diana bajo condiciones fisiológicas y disminuye la expresión del gen diana en la célula. En este método se puede utilizar cualquiera de los ácidos nucleicos dirigidos a R2 descritos. La célula puede ser una célula tumoral o cancerosa, una célula patógena o una célula normal. En determinadas realizaciones, la célula normal experimenta una proliferación no deseada que conduce a una determinada enfermedad o condición en un paciente.

En determinadas secciones, la solicitud describe métodos para reducir la tasa de crecimiento tumoral en un sujeto, incluyendo la administración de un inhibidor de R2 aquí descrito en cantidad suficiente para reducir la tasa de crecimiento del tumor. En ciertos aspectos, la solicitud describe métodos... [Seguir leyendo]

1. Ácido nucleico que comprende:

(i) una primera cadena de 15 a 30 nucleótidos de longitud que comprende la SEQ ID NO 4; y

(ii) una segunda cadena de 15 a 30 nucleótidos de longitud;

donde al menos 12 nucleótidos de la primera y la segunda cadena son complementarios entre sí y forman un ácido nucleico bicatenario bajo condiciones fisiológicas y donde el ácido nucleico bicatenario puede reducir la expresión de una subunidad 2 (R2) de la ribonucleótido-reductasa en una célula mediante un mecanismo de ARN-interferencia.

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado porque es un ARN bicatenario.

3. Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado porque es un ARN en horquilla.

4. Ácido nucleico según la reivindicación 3, caracterizado porque la región de bucle del ARN en horquilla tiene una longitud de 4 a 10 nucleótidos.

5. Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado porque la parte bicatenaria del ARN tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos.

6. Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado porque la primera cadena es un ADN polinucleótido y la segunda cadena es un ARN polinucleótido.

7. Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado porque la primera y/o la segunda cadena comprenden además una región protuberante en el extremo 3', una región protuberante en el extremo 5' o regiones protuberantes tanto en el extremo 3' como en el extremo 5'.

8. Ácido nucleico según la reivindicación 7, caracterizado porque la región protuberante tiene de 1 a 10 nucleótidos de longitud.

9. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una o más fracciones con modificaciones de esqueleto o de bases.

10. Ácido nucleico según la reivindicación 9, caracterizado porque las fracciones con modificaciones de esqueleto

o bases son una o más de las siguientes: alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, fosforoamidatos, ésteres fosfato, carbamatos, acetamidato, ésteres carboximetilo, carbonatos y triésteres fosfato.

11. Ácido nucleico según la reivindicación 10, caracterizado porque comprende al menos un ribonucleótido 2'-Oalquilado.

12. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque la primera cadena comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs 7, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 y 43.

13. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque la segunda cadena comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs 8, 14, 16, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 44.

14. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque inhibe la expresión de R2 en células en un 50% o más cuando se pone en contacto con las células bajo condiciones fisiológicas a una concentración 10 nanomolar.

15. Molécula de ARNi aislada que comprende una secuencia que se hibrida en una región de un transcripto de R2 correspondiente a los nucleótido.

42. 485 de la SEQ ID NO 1 bajo condiciones fisiológicas y reduce la expresión de la R2 en una célula.

16. Molécula de ARNi aislada según la reivindicación 15, caracterizada porque comprende una secuencia que se hibrida en una región de un transcripto de R2 correspondiente a los nucleótido.

43. 475 de la SEQ ID NO 1.

17. Molécula de ARNi aislada según la reivindicación 15, caracterizada porque comprende una secuencia que se hibrida en una región de un transcripto de R2 correspondiente a los nucleótido.

43. 470 de la SEQ ID NO 1.

18. Molécula de ARNi según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizada porque comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos que son complementarios a una de dichas regiones de R2.

19. Molécula de ARNi según la reivindicación 18, caracterizada porque tiene una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 50 nucleótidos.

20. Molécula de ARNi según la reivindicación 19, caracterizada porque es una molécula de ARNi monocatenaria.

21. Molécula de ARNi según la reivindicación 19, caracterizada porque es una molécula de ARNi bicatenaria.

22. Molécula de ARNi según cualquiera de las reivindicaciones 15-20, caracterizada porque es una molécula de ARN que opcionalmente comprende una o más fracciones con modificaciones de esqueleto o de bases.

23. Molécula de ARNi según cualquiera de las reivindicaciones 15-20, caracterizada porque comprende una cadena de ADN y una cadena de ARN y opcionalmente una o más fracciones con modificaciones de esqueleto

o de bases.

24. Molécula de ARNi según cualquiera de las reivindicaciones 15-23, caracterizada porque es una molécula de ARN en horquilla que opcionalmente comprende una o más fracciones con modificaciones de esqueleto o de bases.

25. Molécula de ARNi según la reivindicación 24, caracterizada porque la parte dúplex de la molécula de ARNi tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos.

26. Molécula de ARNi según la reivindicación 25, caracterizada porque la molécula de ARNi comprende la SEQ ID NO 4, opcionalmente incluyendo una o más fracciones con modificaciones de esqueleto o de bases.

27. Molécula de ARNi según la reivindicación 26, caracterizada porque la molécula de ARNi comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs 7, 8, 13-16 .

2. 44, opcionalmente incluyendo una o más fracciones con modificaciones de esqueleto o de bases.

28. Molécula de ARNi según la reivindicación 27, caracterizada porque comprende al menos un enlace internucleotídico seleccionado de entre el grupo consistente en alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, fosforoamidatos, ésteres fosfato, carbamatos, acetamidato, ésteres carboximetilo, carbonatos y triésteres fosfato.

29. Molécula de ARNi según la reivindicación 28, caracterizada porque comprende al menos un ribonucleótido 2'O-alquilado.

30. Molécula de ARNi según cualquiera de las reivindicaciones 15-29, caracterizada porque inhibe la expresión de R2 en las células en un 50% o más cuando se pone en contacto con las células bajo condiciones fisiológicas a una concentración 10 nanomolar.

31. Composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico o la molécula de ARNi según cualquiera de las reivindicaciones 1-30 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. Composición farmacéutica según la reivindicación 31, caracterizada porque el vehículo farmacéuticamente aceptable incluye un polímero catiónico.

33. Composición farmacéutica según la reivindicación 32, caracterizada porque el vehículo farmacéuticamente aceptable incluye un polímero de ciclodextrina.

34. Composición farmacéutica según la reivindicación 33, caracterizada porque la estructura de la ciclodextrina es CDP-im tal como se ilustra en la Figura 27.

35. Composición farmacéutica según la reivindicación 34, caracterizada porque comprende una partícula que incluye un polímero de ciclodextrina y el ácido nucleico o la molécula de ARNi según cualquiera de las reivindicaciones 1-30 y está PEGilada.

36. Composición farmacéutica según la reivindicación 35, caracterizada porque la partícula comprende además adamantano.

37. Composición farmacéutica según la reivindicación 36, caracterizada porque adicionalmente comprende un ligando dirigido a un tipo de tejido o célula particular.

38. Composición farmacéutica según la reivindicación 37, caracterizada porque el ligando comprende galactosa.

39. Composición farmacéutica según la reivindicación 38 que comprende nanopartículas, caracterizada porque las nanopartículas tienen un diámetro de 10 a 100 nm.

40. Composición farmacéutica según la reivindicación 39, caracterizada porque las nanopartículas tienen un diámetro de aproximadamente 50 a 70 nm.

41. Composición farmacéutica según la reivindicación 40, caracterizada porque las nanopartículas tienen un diámetro de aproximadamente 50 nm.

42. Composición farmacéutica según la reivindicación 31, caracterizada porque el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende: un polímero catiónico que contiene ciclodextrina modificado con imidazol, y

una fracción dirigida que comprende adamantano-PEG-ligando, formando el polímero y la fracción dirigida nanopartículas que encapsulan el ácido nucleico.

43. Composición farmacéutica según la reivindicación 42, caracterizada porque las nanopartículas tienen un diámetro de aproximadamente 50 a 120 nm.

44. Composición farmacéutica según la reivindicación 42, caracterizada porque las nanopartículas tienen un diámetro de aproximadamente 50 a 100 nm.

45. Composición farmacéutica según la reivindicación 42, caracterizada porque las nanopartículas tienen un diámetro de aproximadamente 50 a 70 nm.

46. Composición farmacéutica según la reivindicación 45, caracterizada porque las nanopartículas tienen un diámetro de aproximadamente 50 nm.

47. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicacione.

4. 46, caracterizada porque el ligando dirigido comprende galactosa.

48. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicacione.

4. 46, caracterizada porque el ligando dirigido comprende transferrina.

49. Utilización del ácido nucleico o la molécula de ARNi según cualquiera de las reivindicaciones 1-30 en la producción de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada a una proliferación celular no deseada.

50. Utilización según la reivindicación 49, caracterizada porque las células son células cancerosas o tumorales.

51. Utilización según la reivindicación 49, caracterizada porque las células son células patógenas.

52. Utilización según la reivindicación 49, caracterizada porque las células son células normales cuya proliferación no deseada conduce a una enfermedad o afección.

53. Utilización según cualquiera de las reivindicacione.

4. 52, caracterizada porque el ácido nucleico o la molécula de ARNi se formula con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

54. Utilización según la reivindicación 53, caracterizada porque el ácido nucleico o la molécula de ARNi se formula con un ligando dirigido a células cancerosas.

55. Utilización según la reivindicación 54, caracterizada porque el ligando es transferrina.

56. Utilización según la reivindicación 54, caracterizada porque la célula cancerosa es un hepatocito y el ligando comprende galactosa.

57. Utilización según cualquiera de las reivindicacione.

4. 56, caracterizada porque el ácido nucleico o la molécula de ARNi se formula como un componente de una nanopartícula polimérica.

58. Utilización según la reivindicación 57, caracterizada porque la nanopartícula tiene un diámetro de 10 a 120 nm.

59. Utilización según la reivindicación 57, caracterizada porque la nanopartícula tiene un diámetro de 50 a 120 nm.

60. Utilización según la reivindicación 57, caracterizada porque la nanopartícula tiene un diámetro de 50 a 100 nm.

61. Utilización según la reivindicación 57, caracterizada porque la nanopartícula tiene un diámetro de 50 nm.

62. Utilización según cualquiera de las reivindicacione.

5. 61, caracterizada porque dicho medicamento se administra de forma sistémica.

63. Utilización según la reivindicación 62, caracterizada porque dicho medicamento se administra por administración arterial intrahepática.

64. Utilización según la reivindicación 63, caracterizada porque el cáncer es cáncer de hígado.

65. Utilización según cualquiera de las reivindicacione.

4. 64, caracterizada porque la célula cancerosa expresa

un mayor nivel de R2 en comparación con una célula no cancerosa de un tejido comparable.

66. Utilización según la reivindicación 65, caracterizada porque adicionalmente incluye al menos un agente

quimioterapéutico adicional contra el cáncer que inhibe células cancerosas de forma aditiva o sinérgica con el 5 ácido nucleico o la molécula de ARNi.

67. Utilización según la reivindicación 66, caracterizada porque el agente quimioterapéutico es fluorouracilo (5FU) .

68. Composición farmacéutica de suministro específico al hígado, que comprende: un agente terapéutico hepático, y un vehículo de suministro que comprende (i) un polímero catiónico conteniendo ciclodextrina modificado con

imidazol, y (ii) una fracción dirigida que comprende adamantano-PEG-ligando, formando el polímero y la fracción dirigida nanopartículas que encapsulan el ácido nucleico.

FIGURA 1

FIGURA 2

FIGURA 5

Nivel de Proteína hRRM2

Reducción de pR2Luc Co-suministrado en Células HepG2

Sub-regulación de pR2Luc co-suministrado en Sub-regulación de pR2Luc co-suministrado

Inducción de Apoptosis mediante ARNsi en Células HepG2 (en función del tiempo después de la transfección) El ARNsi Contra la R2 Aumenta la Apoptosis Inducida por Adriamicina de Células HepG2

(% de pR2Luc medio en cada ocasión)

Imágenes tomadas 2 d después de la inyección Inyecciones HPTV en Ratones BALB/c Hembra (todas a la misma escala)

Ensayo de Formación de Colonias:Células Hep3B: Diversos ARNsi Contra la R2 Ensayo de Formación de Colonias:Células Hep3B: ARNsi de Control (siCON1) frente a ARNsi contra la R2 (siR2B+5)

Ensayo de Formación de Colonias:

Cuantificación de los Niveles de la Proteína R2 en

% Dosis en hígado FIGURA 25

FIGURA 27

Toxicidad con Células BHK-21

Relación [EWSFLI1]/[Actina]

FIGURA 30

Tamaño dePartícula (nm)

Concentración Final de ADN (mg/ml)

FIGURA 34

potencial Z (mV)

Partículas 90

Concentración (g/l)

FIGURA 39

Resumen de Resultados de qRT/PCR

Día 40